[发明专利]一种快速鉴定烟草抗性基因的有效方法

摘要

本发明公开了一种快速鉴定烟草抗性基因的有效方法，本发明所用的农杆菌株系为GV3101(pMP90),属根癌农杆菌，在烟草的遗传转化中效果比较好。采用的转化方法是电击转化法，而不是常用的冻融法或热激法，使用伯乐公司的电转化仪，其转化参数为0.1cm电击杯、输出25mF、电压1.8kV和抗性200W，提高了转化效率；本发明所用的培养基是最常用的LB培养基，而不是较复杂的YEP或YEB培养基，且所加抗生素分别为25mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平，可以有效的杀死没有转化成功的农杆菌，节省了筛选时间。

主权项

一种快速鉴定烟草抗性基因的有效方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）、将含有目的基因和TMV复制酶基因的两个表达载体分别通过电击法导入农杆菌GV3101(pMP90)感受态细胞；（2）、加1mLSOC培养基或LB培养基，在28℃恒温培养箱中培养1h；（3）、将所得培养物涂布于含有25 mg/mL卡那霉素和50 mg/mL利福平的LB固体平板培养基上，在28℃过夜培养2晚；(4)、挑取单菌落于含有25 mg/mL卡那霉素和50 mg/mL利福平的5 mL LB液体培养基中，在28℃的摇床上震荡培养1‑2天至对数生长期，得过夜培养物；（5）、取0.3 mL过夜培养物置于含50 mg/mL卡那霉素、10 mmol/L pH 5.6 的MES和20 mmol/L乙酰丁香酮的5 mL LB液体培养基中，28℃培养3‑4h；（6）、在室温、3000rpm条件下将所得产物离心30min，沉淀物用含10 mmol/L氯化镁、10 mmol/L pH 5.6 的MES 和150 mmol/L乙酰丁香酮的5 mL浸润缓冲液重悬至OD600为0.5的农杆菌悬浊液；（7）、含有目的基因和TMV复制酶基因的农杆菌悬浊液按1:1混和，放置室温下静置培养2‑3h，得实验用农杆菌悬浊液；(8)、选用6‑8周龄健壮Nicotiana tabacum或Nicotiana benthamiana为材料，用针尖在叶片背腹面划一小口；(9)、用1mL无针注射器将实验用农杆菌悬浊液浸润到烟草叶片，在20‑28℃光照培养箱中培养，进行抗性反应观察；(10)、如果出现过敏性反应，则表明该目的基因对烟草花叶病毒具有抗性；如果不出现过敏性反应，则说明其不具有抗性；其中：步骤（1)的电击法使用伯乐公司的电转化仪，其转化条件为0.1 cm 电击杯、输出 25 mF、电压1.8 kV和 抗性200 W；步骤（10）的抗性反应观察中，所述的过敏性反应指的是烟草感染部位局部的细胞死亡形成坏死斑。