[发明专利]一种白桦高效转基因方法

摘要

一种白桦高效转基因方法，涉及一种植物转基因的方法。该方法是要解决现有白桦转基因方法转化效率低，脱菌过程复杂的问题。该方法按以下步骤进行：一、将继代培养的无根苗两次生根培养，选取适用于农杆菌侵染的健壮叶片；二、农杆菌侵染；三、共培养；四、通过愈伤培养、分化培养、继代培养和生根培养，最终获得转基因植株。该方法通过选择适宜生理状态的外植体，大大增强了叶片抵抗农杆菌感染的能力、加速伤口侵染几率，脱菌次数由原来的20～25次减少到7～10次，白桦转基因效率提高了2.32～3倍。该方法可应用于白桦转基因领域。

主权项

一种白桦高效转基因方法，其特征在于上述方法按以下步骤进行：一、选取高度为1～1.5cm继代培养的白桦无根苗，在生根培养基中培养24～26天，去除根部再次移入生根培养基中继续培养30～35天，选取苗高为5～6cm白桦植株的第2或第3片叶片基部的0.2～0.3cm处叶片组织，用于农杆菌的侵染；二、将步骤一中叶片组织浸入农杆菌菌液中侵染，其中菌液OD600为0.1，侵染时间为3～5min，将侵染后的叶片放置在无菌滤纸上吸去附着的菌液，更换滤纸再次吸取菌液；三、将步骤二中浸染后的叶片近轴面向下接种在愈伤诱导培养基上，在温度为25℃的黑暗条件下进行共培养，培养至第二天，用无菌吸水纸擦拭叶片表面的农杆菌，再将叶片移入新的愈伤诱导培养基中继续共培养，每天脱菌1次，3～4d结束共培养；四、将步骤三中共培养的叶片转接至含选择剂和抑菌剂的愈伤诱导培养基上，25℃光照条件下进行选择培养，15d后在切口处可见抗性愈伤组织形成，将抗性愈伤组织切下转接到含选择剂和抑菌剂的分化培养基中，15～20d后产生抗性不定芽，将抗性芽转接到含选择剂和抑菌剂的继代培养基中，待不定芽长到1～1.5cm时，转接到含选择剂和抑菌剂的生根培养基上进行生根培养，15d后长出不定根，即获得转基因株系；其中步骤一中所述的生根培养基包含WPM培养基和浓度为0.2～0.4mg/L的IBA；步骤三中所述的愈伤诱导培养基包含WPM培养基、浓度为0.8～1.2mg/L的6‑BA和浓度为0.02～0.06mg/L的NAA；步骤四中所述的含选择剂和抑菌剂的愈伤诱导培养基包含WPM培养基、浓度为0.8～1.2mg/L的6‑BA、浓度为0.02～0.06mg/L的NAA、选择剂及抑菌剂，所述的含选择剂和抑菌剂的分化培养基包含WPM培养基、浓度为0.8～1.2mg/L的6‑BA、浓度为0.02～0.06mg/L的NAA、浓度为0.4～0.5mg/L的GA3、选择剂及抑菌剂，所述的含选择剂和抑菌剂的继代培养基包含WPM培养基、浓度为0.8～1.0mg/L的6‑BA、选择剂及抑菌剂，所述的含选择剂和抑菌剂生根培养基包含WPM培养基和浓度为0.2～0.4mg/L的IBA及选择剂，其中所述的抑菌剂为浓度为250～300mg/L的头孢霉素或浓度为250～300mg/L的Timentin。