[发明专利]人椎间盘髓核细胞和免疫细胞相互作用的体外模型构建方法

摘要

人椎间盘髓核细胞和免疫细胞相互作用的体外模型构建方法，即通过建立模型研究人椎间盘免疫赦免的作用机制。本发明共培养模型较好模拟了体外人髓核细胞和免疫细胞相互作用，可为体外椎间盘免疫研究提供一种新的实验思路。发明人已在研究：FasL在椎间盘免疫赦免中的作用机制研究中，采用该共培养模型。此研究通过上调椎间盘退变患者髓核细胞中的FasL表达量，并与免疫细胞共培养后发现，FasL在髓核细胞中的上调可有效增加免疫细胞的凋亡比例。

主权项

人椎间盘髓核细胞和免疫细胞相互作用的体外模型构建方法，其特征在于：1）人髓核细胞分离及培养首先将髓核组织在无菌条件下分离，弃去其中的纤维环组织节软骨板，将剩余的髓核组织在室温下置于胰蛋白酶溶液中消化，随后离心弃去上清液，在室温下用Ⅱ型胶原酶静止消化后，再离心，弃去上清液，细胞用PBS液冲洗离心后以45μm孔径的尼龙过滤网滤去剩余组织，计数板进行细胞计数；再以胎牛血清的DMEM/F12培养液将细胞接种于培养瓶内，置于37℃含CO2的培养箱中进行培养，每三天换液一次；2）人外周血巨噬细胞的分离及培养2.1）外周血单核细胞(PBMCs)分离利用肝素抗凝管抽取外周血，以1:3的体积比将抽取的外周血加入RPMI‑1640培养基并混匀，随后再以1:1的体积比缓慢加至细胞分离液Ficoll‑Paque中，室温下以800×g离心30分钟，随后吸取白膜层即为外周血单核细胞；2.2）巨噬细胞分离及培养将外周血单核细胞接种于含胎牛血清的RPMI‑1640培养液的培养瓶中，置于37℃含CO2的培养箱中进行培养，24h后，弃去培养瓶中上清液，即去除非粘附细胞，向剩余的粘附细胞中加入18ng/mL浓度的粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子(GM‑CSF)和20ng/mL浓度的巨噬细胞集落刺激因子(M‑CSF)，培养5天后，得到的粘附细胞即为外周血巨噬细胞；3）人外周血CD8+T细胞分离及培养利用CD8+T‑cell Positive Isolation Kit试剂盒，根据说明，对外周血淋巴细胞逐步分离，得到外周血中的CD8+T细胞；4）人髓核细胞和免疫细胞相互作用的体外模型采用半透膜孔径为0.4μm的Transwell inserts插入式小室建立非接触共培养模型，将第1步得到的髓核细胞与免疫细胞（即巨噬细胞或CD8+T细胞）按1：1的体积比共培养；具体操作为：以1.5×106/孔的数目将髓核细胞接种于六孔板，以含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液作为培养基；将1.5×106的巨噬细胞或CD8+T细胞接种于Transwell inserts小室，并插入六孔板中，共养48小时后，根据实验目的对髓核细胞、巨噬细胞或CD8+T细胞进行相关检测。