[发明专利]使用细胞内同步表达法在T4噬菌体表面展示外源蛋白大分子的方法

摘要

本发明是一种使用细胞内同步表达法在T4噬菌体表面展示外源蛋白大分子的方法，其步骤如下：带有T4噬菌体天然调控区的Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的表达质粒的构建；将外源重组蛋白的表达质粒转化进入大肠杆菌细胞内：以Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体病毒株感染含有外源重组蛋白表达质粒的大肠杆菌细胞；分离从以上的感染步骤中产生的展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒；检测所获得的T4噬菌体颗粒的衣壳上所展示的外源重组蛋白。本发明方法无需进行外源重组蛋白的过表达，避免了体外展示法中需要外源重组蛋白大量过表达的技术瓶颈；无需进行外源重组蛋白的分离纯化，避免了耗时且昂贵的蛋白分离纯化过程。

主权项

一种使用细胞内同步表达法在T4噬菌体表面展示外源蛋白大分子的方法，其特征在于，其步骤如下：（一）带有T4噬菌体天然调控区的Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的表达质粒的构建：（1）将Hoc蛋白或Soc蛋白的基因编码区与所需展示的外源蛋白的基因编码区融合，并在序列上游加入T4噬菌体控制Hoc蛋白或Soc蛋白表达的天然调控区域；外源蛋白选自任意蛋白；融合后形成带有调控序列的编码Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的基因序列；含有此序列的质粒在大肠杆菌细胞内会在T4噬菌体感染装配的过程中同步表达外源重组蛋白；（2）制备包含质粒复制所需区域和抗生素抗性基因的基因片段；依据所需要的抗性基因和质粒复制区序列，选择合适的商业可获得的质粒载体，并通过PCR的方法扩增所选择的质粒载体的抗性基因和质粒复制所需区域；PCR的方法为：根据所选择的质粒载体的序列，在质粒复制所需区域和抗性基因的上下游选择合适区段设计PCR引物；PCR引物的设计基于PCR反应所设计的一对引物覆盖整个质粒复制所需区域和抗性基因；然后使用质粒载体的DNA为模板，使用标准的Taq酶并按照Taq酶设定的标准PCR循环进行PCR操作；（3）以DNA连接酶按照商业公司提供的标准方法将从以上步骤获得的抗生素抗性基因和质粒复制所需区域以及Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的基因片段连接起来，并通过标准的化学转化法将其转化进入XL10‑Gold感受态细胞内；培养细胞，进行质粒扩增，即得到带有T4噬菌体天然调控区的Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的表达质粒；（二）将外源重组蛋白的表达质粒转化进入大肠杆菌细胞内：以传统的生物化学方法制作大肠杆菌细胞的感受态细胞，并将外源重组蛋白的表达质粒以标准的化学转化方法转化进入大肠杆菌感受态细胞内；（三）以Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体病毒株感染含有外源重组蛋白表达质粒的大肠杆菌细胞：将含有外源重组蛋白表达质粒的大肠杆菌细胞在37摄氏度摇床中以180‑270转/分钟的摇速培养至细菌细胞密度1.5‑6×108/毫升LB培养基，然后以MOI感染复数= 0.1‑1.0用Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体感染细胞，并在37摄氏度摇床中以180‑270转/分钟的摇速培养3‑4个小时；个过程中，T4噬菌体不断装配扩增，与T4噬菌体装配同步表达的外源重组蛋白已经展示在T4噬菌体衣壳上；（四）分离从以上的感染步骤中产生的展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒：以差速离心法将以上感染产物的培养基上清与展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒、尚未破裂的大肠杆菌细胞以及感染所产生的细胞残骸分离开来，离心力34,500g；丢弃上清，并以PI‑Mg缓冲液重悬离心所得的沉降物；加入DNaseI至10微克/毫升的终浓度，并在37摄氏度培养30分钟以消化DNA；之后再以差速离心法去除细胞及残骸，离心力4,300g，丢弃离心沉降物并保留上清；上清中含有较纯的展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒；以高速离心的方法将噬菌体颗粒沉降下来，离心力34,500g，去除上清，再以PI‑Mg缓冲液重悬噬菌体颗粒，从而获得具有较高浓度的展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒悬浮液，在4摄氏度长期稳定保存；（五）检测所获得的T4噬菌体颗粒的衣壳上所展示的外源重组蛋白：对于T4噬菌体颗粒衣壳上所展示的外源重组蛋白，检测方法的选择基于外源蛋白本身的性质。