[发明专利]一种简易、快速、灵敏的东海原甲藻现场检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种简易、快速、灵敏的东海原甲藻现场检测试剂盒。所述的试剂盒由自然样品核酸粗提试剂、反转录特异性引物溶液、反转录溶液、核酸扩增反应液、核酸扩增引物及显色液等组成。该检测试剂盒的检测原理是以藻细胞的rRNA为靶序列，通过核酸的反转录制备模板，环介导等温扩增靶序列。试剂盒的检测过程只需简易的设备，检测快速，检测结果可通过肉眼直接进行判断，且具有较高的灵敏度，可用于日常水环境的现场检测，对东海原甲藻赤潮的预警有一定的实用价值。

主权项

一种简易、快速、灵敏的东海原甲藻现场检测试剂盒，其特征在于，由以下试剂组成：(1) 试剂A为自然样品核酸粗提试剂，其组成为：2% (m/v) CTAB, 0.5% (v/v) β‑mercaptoethanol, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris‑Cl, 10 U RNase Inhibitor；（2）试剂B为反转录特异性引物溶液，其浓度为：10 μmol/L；核酸序列为：5’‑ CCTTGGTCCGTCTTTCAAGA ‑3’；（3） 试剂C为反转录反应液I，其组成为：142.86 mM Tris‑HCl， 214.29 mM KCl; 8.57 mM MgCl2, 28.57 mM DTT和11.43 mM dNTP；（4）试剂D为反转录反应液II，其组成为：20 U/μL RNase Inhibitor，100 U/μL RTase M‑MLV；（5）试剂E为核酸扩增反应液I，组成为：(5.1)内部引物：浓度：2.17 μM；核酸序列 (PLF3)：5’‑CCTGCCTTGTGTGTCA ACG ‑3’, 核酸序列 (PLB3)：5’‑AGTCATCGTCTTTGCG TCAG ‑3’； (5.2)外部引物：浓度：0.22 μM；核酸序列 (PLFIP)：5’‑CCGCAAATGAGTTCTGCCAAGGTTTTGCGATCGAGGAAAACTCCA‑3’, 核酸序列(PLBIP)：5’‑GTCTGGTTGCAGTGTCTTTGGCTTTTAAATGCCCAAGTCACCTGG‑3’)；(5.3) 0.43 mM dNTP；(5.4)1.09 M 甜菜碱；(5.5) Bsm Buffer：21.74 mM Tris‑HCl (pH 8.8), 10.87 mM KCl, 10.87 mM (NH4)2SO4, 2.17 mM MgSO4, 0.11% (v/v) Triton X‑100；（6）试剂F为核酸扩增反应液II，即8 U/μL Bsm DNA polymerase large fragment；（7）试剂G为显色液GeneFinderTM；（8）对照:(8.1)阳性对照检测样品：东海原甲藻的总RNA；(8.2)阴性对照检测样品：赤潮异湾藻的总RNA。