[发明专利]共表达精氨酸酶和天门冬氨酸酶制备门冬氨酸鸟氨酸的方法

摘要

一种共表达精氨酸酶和天门冬氨酸酶制备门冬氨酸鸟氨酸的方法。本发明采用基因工程方法，构建能高效共表达精氨酸酶和天门冬氨酸酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET24a(+)-arg-asp，以发酵菌体细胞为酶源，在同一个反应体系内，双酶分别催化底物L-精氨酸、延胡索酸铵反应，生成L-鸟氨酸和L-天门冬氨酸，转化液收集后通过1万截留分子量中空纤维素柱去除大分子量杂质及活性炭脱色、减压浓缩，加入无水乙醇，冰水浴搅拌冷却析出得天门冬氨酸鸟氨酸。本发明提供了一种新的门冬氨酸鸟氨酸的绿色生产工艺方法，该方法具有条件温和、周期短、酶促体系中杂质少、产物分离提取方便、工艺步骤简单、操作安全等优点，有很好的产业化应用前景。

主权项

一种共表达精氨酸酶和天门冬氨酸酶制备门冬氨酸鸟氨酸的方法，其特征在于该方法包括：首先PCR扩增来源于枯草芽孢杆菌的天门冬氨酸酶基因，采用基因工程方法构建重组表达质粒pET‑20b(+)‑asp；然后以pET‑20b(+)‑asp为模板，PCR扩增获得产物为5’端带有T7启动子和rbs序列的天门冬氨酸酶基因，采用基因工程方法，将该基因克隆到pET‑24a(+)‑arg中，获得重组质粒pET‑24a(+)‑arg‑asp；将重组表达载体转化至E.coli BL21(DE3)，获得共表达基因工程菌株BL21(DE3)‑pET24a(+)‑arg‑asp，该重组菌体细胞能同时表达有高活性的精氨酸酶和天门冬氨酸酶；以该重组菌为酶源，在同一个反应体系中，分别催化底物L‑精氨酸和延胡索酸铵，其中底物L‑精氨酸的用量为0.1至1mol/L，延胡索酸铵的用量为0.1至1mol/L，菌体的添加量为4‑6g/L，在30至45℃下，pH8至10，以1mmol/L无水硫酸镁为辅助因子，经酶法转化反应4至12h，生成L‑鸟氨酸和L‑天门冬氨酸，收集转化液后，通过1万截留分子量中空纤维素柱去除大分子量杂质及活性炭脱色，最后减压浓缩，加入3倍体积无水乙醇，冰水浴搅拌冷却析出，收集沉淀得天门冬氨酸鸟氨酸。