[发明专利]一种同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法

摘要

本发明公开了一种同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株的构建包括以下步骤：(1)采样；(2)内蒙古白绒山羊耳尖皮肤组织原代培养；（3）皮肤成纤维细胞与上皮细胞的分离与纯化。本发明经过一次原代培养同时获得了高活力的内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株,为深入开展内蒙古白绒山羊转基因研究、分子生物学及细胞生物学的相关研究提供了试验材料与技术支持。

主权项

一种同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，其特征在于：皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株的构建包括以下步骤：（1）采样:从雄性成年内蒙古白绒山羊个体的耳尖部取皮肤组织，用含双抗的生理盐水冲洗，然后去除附着在皮肤上的脂肪和结缔组织基膜层，露出真皮层后，置于70‑75%酒精中浸泡约45‑60s后，再用含双抗的PBS洗涤，置于含双抗的DMEM/F12培养液中，剪碎；（2）内蒙古白绒山羊耳部皮肤组织原代培养:将皮肤组织块均匀接种在培养瓶的瓶壁，加入含胎牛血清、表皮细胞生长因子和双抗的DMEM/F12培养液，拧紧瓶盖，以组织块在上、培养液在下的方式放入培养箱，静置3～4h后，轻轻将培养瓶翻转，使培养液浸没组织块，在培养箱内静置培养，每2‑4d更换一次新鲜培养液，培养11‑17d后，得到皮肤成纤维细胞与上皮细胞的混合原代细胞培养物；（3）皮肤成纤维细胞与上皮细胞的分离与纯化：将步骤（2）所得混合原代细胞培养物用PBS清洗，再用1‑2mL含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的D‑Hanks液消化，至大部分细胞回缩及有少量细胞漂起后，立即终止消化，用移液枪吹打使细胞悬浮，吸取细胞悬液离心弃上清后，接种入新的培养瓶中，放入培养箱培养，通过2～3次选择传代，得纯化的皮肤成纤维细胞株；吸取所述细胞悬液后的培养瓶用PBS洗涤，加入含胎牛血清、表皮细胞生长因子和双抗的DMEM/F12培养液继续放入培养箱培养，待表皮细胞长满瓶底时，消化传代，通过2～3次选择传代，得纯化的表皮细胞株。