[发明专利]鸡血中抗菌肽的提取方法

摘要

本发明公开了一种鸡血中抗菌肽的提取方法，它包括以下具体步骤：（1）鸡血采集；（2）萃取；（3）除酸、浓缩；（4）抗菌肽的分离；（5）抗菌肽的纯化与浓缩。本提取方法简单易懂，提取的抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌均有高效广谱的杀伤作用，纯化产物的抑菌效果高于6000单位青霉素的抑菌效果，粗提物和纯化物对大肠杆菌均有着较强的抑菌效果。

主权项

一种鸡血中抗菌肽的提取方法，其特征在于：它包括如下具体步骤：一、鸡血采集：从屠宰场采取新鲜鸡血2‑3L,使用5%柠檬酸钠抗凝；二、萃取：将新鲜鸡血放置37℃温箱静置1‑2h，取上清按照1：4的比例加入0.84%氯化铵溶液，混匀静置3min，常温400r/min离心10min，弃上清按比例加入氯化铵溶液混匀静置3min，再次500r/min离心10min；弃上清，使沉淀与少量4℃的生理盐水短时间混合，再用200ml的4℃的10%冰醋酸使沉淀悬浮，充分混匀，倒入50ml烧杯，超声波处理50次，然后溶液使用磁力搅拌器混匀搅动于4℃下萃取一夜；次日，将萃取的溶液取出15000r/min离心30min，取上清4℃下保存，沉淀再次混悬于冷的10%醋酸中，充分混匀，混匀搅动于4℃下萃取一夜；第三天将萃取的溶液取出15000r/min离心30min，最后将溶液4℃下保存；三、除酸、浓缩：合并所保存的溶液,将溶液注入透析袋,扎紧袋口,然后将其放入烧杯,再向烧杯中倒入蒸馏水,蒸馏水液面要超过透析袋，4℃下透析除酸，每12h换水一次，直至透析袋外蒸馏水pH大于6，将透析袋放入瓷盘中，撒上聚乙二醇6000,透析浓缩约3‑4h后即可将透析袋取出，将浓缩的溶液取出低温冻干，转移至青霉素小瓶中,密封‑20℃保存；四、抗菌肽的分离：将冻干样品用0.5%甲醇溶解,再上样于层析柱葡聚糖凝胶SephadexG25，同时打开柱的下端出口，注意控制流速为1mL/min，5mL/管，用部分收集器收集洗脱液，5mL/管，收集的溶液用紫外分光光度计测其在280nm处的吸收值，将在280nm处有吸收的溶液分装于青霉素瓶中，再在低温冻干机中冻干，‑80℃保存，取各瓶冻干保存的样品各20mg，分别溶于灭菌双蒸水中,无菌条件下用微孔滤膜过滤样品,将药敏纸片浸泡于过滤后的样品中,浸泡过夜后,用平皿纸片法初筛，收集具有抗菌活性的组分，置于5℃保存；五、抗菌肽的纯化与浓缩：使用超滤装置进行超滤，膜包选用截流分子量为20kD，洗脱液选用0.5%甲醇溶液，滤出液既为所要获得的溶液。