[发明专利]一种高通量乙型脑炎病毒解旋酶抑制剂的药物筛选模型的建立方法

摘要

本发明公开了一种高通量乙型脑炎病毒解旋酶抑制剂的药物筛选模型的建立方法，步骤：1、解旋酶蛋白的表达与纯化：人工合成乙型脑炎病毒NS3基因，用NcoI和XhoI分别酶切解旋酶片段与大肠杆菌原核表达载体过夜连接，得一种解旋酶蛋白，其序列为SEQIDNO.1所示，收集表达蛋白的上清，用Ni2+亲和层析法纯化解旋酶蛋白，用BCA法测定蛋白浓度；2、解旋酶DNA底物的设计；3、在黑色96孔中加入解旋酶蛋白3uM、待筛化合物以及反应缓冲液，混合孵育，在荧光检测仪中检测体系中的荧光强度，不加入底物的对照组；4、计算化合物抑制率。方法简单易行，灵敏度高，成本低，样品少，对解旋酶反应的过程进行监测，对今后的乙型脑炎病毒药物的开发具有极大意义。

主权项

一种高通量乙型脑炎病毒解旋酶抑制剂的药物筛选模型的建立方法，其制备步骤如下：（1）解旋酶蛋白的表达与纯化：人工合成乙型脑炎病毒NS3基因，用Nco I和Xho I分别酶切解旋酶片段与大肠杆菌原核表达载体pET30a，T4 DNA Ligase 16℃过夜连接，得到重组质粒pET30a‑helicase，构建好的重组质粒pET30a‑helicase转化到大肠杆菌BL21（DE3）plysS中进行表达，得到一种解旋酶蛋白，其序列为SEQ ID NO.1所示，收集表达蛋白上清用Ni2+亲和纯化，纯化的解旋酶蛋白经SDS‑PAGE及Western blot鉴定后加甘油至终浓度20% v/v，用BCA法测定浓度，‑80℃冻存备用；用大肠杆菌大量表达解旋酶蛋白，在表达蛋白上带有6×His标签，收集表达蛋白的上清，用Ni2+亲和层析法纯化解旋酶蛋白，用BCA法测定蛋白浓度；（2）解旋酶DNA底物的设计：人工合成3条DNA链，分别命名为F、Q、C，序列分别为：F: (Cy5‑)TAGTACCGCCACCCTCAGAACCTTTTTTTTTTTTTT；Q:GGTTCTGAGGGTGGCGGTACTA‑(BHQ2)；C:TAGTACCGCCACCCTCAGAACC；（3）在黑色96孔或384孔板中加入解旋酶蛋白3uM、待筛化合物以及反应缓冲液，混合孵育5分钟后，加入F链200nM与Q链240nM，再孵育5分钟，加入C链2.4uM、15mM Mg2+/10mM的Mn2+和ATP 2mM，置37℃反应90分钟后，在荧光检测仪中检测体系中的荧光强度，同时设置不加入待筛化合物的对照组以及不加入底物的对照组；（4）计算化合物抑制率：抑制率=1‑（实验组荧光平均值‑C1组荧光平均值）÷（C组荧光平均值‑C1组荧光平均值），选择抑制率最高的化合物进行抗病毒的研究。