[发明专利]基于量子点对细胞中重金属离子原位实时检测的方法

摘要

本发明公开了一种基于量子点对细胞中重金属离子原位实时检测的方法，其步骤：A、配制一定浓度羧甲基壳聚糖-CdTe量子点溶液；B、将T25细胞培养瓶中已长满的狗肾细胞消化为单细胞悬浮液，接种到细胞培养皿中，培养；C、向培养皿中加入羧甲基壳聚糖-CdTe量子点溶液，孵育一段时间后得到标记上荧光的狗肾细胞。D、向培养皿中洗涤后的细胞中分别加入含有梯度浓度和未知浓度重金属离子的DMEM营养液，与细胞共同孵育后，用流式细胞仪分别检测细胞的平均荧光强度，通过细胞荧光强度的变化绘制标准曲线即可计算出细胞中重金属离子的浓度。方法操作简便，标记后细胞的荧光会随重金属离子的增加发生有规律的猝灭，实现了对细胞中的外源重金属离子的实时原位检测。

主权项

一种基于量子点对细胞中重金属离子原位实时检测的方法，其步骤是：A、配制0.0000025‑0.001mol/L的羧甲基壳聚糖‑CdTe量子点溶液，根据羧甲基壳聚糖‑CdTe量子点的浓度，用移液管移取0.1~5ml的羧甲基壳聚糖‑CdTe量子点溶液于灭菌的10ml容量瓶中，加入高纯水，电阻率大于 18 MΩ·cm，定容，备用；所述的羧甲基壳聚糖‑CdTe量子点，制备过程是：CdCl2溶液和巯基乙酸溶液混合均匀后用NaOH 溶液调整其pH值为碱性，再向该溶液中加入新制备的KTeH4溶液，将此混合液转入聚四氟乙烯微波消解罐，放入控温的微波加热系统进行加热，反应完成后待溶液冷却至室温20‑25℃，得到CdTe 量子点溶液，将该溶液通过高速离心和透析处理，去除CdTe 量子点溶液中粒径较大的CdTe量子点及反应过程中多余的Cd2+和TGA等小分子物质，得到荧光强度高，杂质含量低的CdTe量子点溶液，将CdTe 量子点与羧甲基壳聚糖溶液混合，羧甲基壳聚糖和CdTe量子点在水相通过静电络合、共价结合、螯合方式自组装，即生成羧甲基壳聚糖‑CdTe量子点荧光探针；B、将T25细胞培养瓶中已长满的狗肾细胞用0.05%体积比的EDTA‑胰蛋白酶消化为单细胞悬浮液，细胞计数后取1×104~1×107的狗肾细胞接种到细胞培养皿中，加入含10%体积比的胎牛血清的DMEM营养液，在37℃、5%体积比的CO2细胞培养箱中培养，使细胞正常贴壁生长繁育，得到用于实施标记的狗肾细胞；C、待步骤B狗肾细胞贴壁生长12~36小时后，向培养皿中加入羧甲基壳聚糖‑CdTe量子点荧光探针，于37℃、5%体积比的CO2细胞培养箱中与细胞共同孵育6~48小时，得到带有荧光的狗肾细胞，弃去DMEM营养液，用pH=7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤2次，用荧光显微镜观察标记；D、向步骤C得到的培养皿中洗涤后的狗肾细胞中加入含有梯度浓度重金属离子的DMEM营养液，与细胞共同孵育12~72小时，弃去营养液，用EDTA‑胰蛋白酶对培养皿底部的细胞进行消化，消化完全后加入1mL生理盐水吹打使细胞脱离培养皿，将该细胞悬浮液分别转入5mL试管，将试管置于离心机中，2000转/min离心5min，弃去上清液，加入生理盐水后用漩涡振荡仪使试管底部的细胞重悬，重复上述的离心和细胞重悬步骤两次，达到对细胞进行清洗以去除未进入细胞的重金属离子，对试管中的细胞计数后用生理盐水将细胞稀释到105~107个/mL，用流式细胞仪检测与含有梯度浓度重金属离子的DMEM营养液共同孵育细胞的平均荧光强度变化，利用荧光动态猝灭方程绘制标准曲线；所述的步骤C得到的培养皿中洗涤后的狗肾细胞中加入含有未知浓度重金属离子的DMEM营养液，按上述方法在同样条件下操作，用流式细胞仪测定与未知浓度重金属离子的DMEM营养液共同孵育细胞的平均荧光强度，根据标准曲线计算出细胞中重金属离子的浓度。