[发明专利]一种检测转cry1Ac基因甘蔗的恒温扩增方法

摘要

本发明涉及一种检测转cry1Ac基因甘蔗的恒温扩增方法，包括甘蔗模板DNA提取、恒温扩增体系的建立和恒温扩增产物的鉴定。转cry1Ac基因甘蔗的恒温扩增检测方法针对抗螟虫转基因甘蔗的外源目的基因cry1Ac的碱基序列，设计了4条特异性引物，在Bst聚合酶作用下进行链置换扩增反应，特异性高。同时，扩增反应仅需水浴锅与可完成瞬时离心的常温低速离心机就能完成，因此，所需仪器设备简单，比常规PCR技术需要昂贵的凝胶扫描系统和PCR仪（或real-timePCR）等，扩增成本相对较低且扩增时间短、效率高，目视法颜色反应看结果直观方便。体系建立后，直接以提取的甘蔗基因组DNA作为模板，是一种适用于实验室和田间筛选转cry1Ac基因甘蔗以及进行cry1Ac基因成分检测、跟踪的低成本、快速、灵敏、简单、准确的方法。

主权项

本发明的一种检测转cry1Ac基因甘蔗的恒温扩增方法，包括甘蔗模板DNA提取、恒温扩增体系的建立和恒温扩增产物的鉴定，其特征在于：恒温扩增检测引物：所使用的检测引物是抗螟虫转基因甘蔗的目的基因cry1Ac的特异检测引物F3、B3、FIP和BIP： 引物F3为5'‑AGAGAGTGGGAAGCCGAT ‑3'；引物B3为5'‑CGAATCCCCACCTTTGCC‑3'；引物FIP为5'‑AGGCGCTGTTCATGTCGTTGACCTACTAACCCAGCTCTCCG‑3'；引物BIP为5'‑TGTCCGTGTACGTTCAAGCAGCCAAACACGCTAACGTCTCGA‑3'；（2）恒温扩增扩增体系的建立：在200 μL离心管中，先加入恒温扩增反应液；所述恒温扩增反应液的组成如下：浓度为50 mmol/L MgSO4液1.5 μL，浓度为10 mmol/L dNTPs液3.5 μL，10×扩增缓冲液2.5 μL，浓度为10 μmol/L的引物FIP 和 BIP各2.0 μL，浓度为10 μmol/L的引物F3和B3各0.5 μL，0.75 μL BstDNA聚合酶，10.75 μL高压灭菌ddH2O，再加入1.0 μL甘蔗模板DNA，混匀后1 000 g, 1s ‑2 s 离心，开盖并在管盖上点上1.0 μL浓度为1,000倍的荧光染料SYBR Green I，闭盖后置于水浴锅中65°C恒温水浴进行扩增，扩增时间为55 min ‑60 min；   （3）恒温扩增产物的鉴定：扩增结束后，将管盖上的染料SYBR Green I与扩增产物混合，待检样品呈明亮的绿色，判定为真实的转cry1Ac基因甘蔗样品。