[发明专利]一种虾原肌球蛋白过敏原基准物的制备方法

摘要

一种虾原肌球蛋白基准物的制备方法，属于生物技术领域。本发明涉及从虾肉中将原肌球蛋白这种主要的过敏原蛋白进行高效稳定的提取和分离纯化的方法，所述原肌球蛋白的纯化采用浸提、热沉淀、亲和层析等多种技术相结合的手段，将高过敏原性的原肌球蛋白从虾肉中分离出来，并保持原有活性。本发明方法获得的原肌球蛋白有助于对虾过敏的针对，并可用于免疫技术检测食品中的虾过敏原。

主权项

一种虾类原肌球蛋白过敏原基准物的制备方法。制备步骤：(1)提取将虾肉打碎并溶解与0.01mol/L、pH7.4，含0.01mg/mL酶抑制剂的磷酸盐缓冲液中，虾肉质量∶磷酸盐缓冲液体积比为1∶20，在4℃条件下磁力搅拌10h，并5000r/min离心20min，收集上清得到虾蛋白的抽提液。(2)热沉淀将虾蛋白抽提液加热至70℃，并保持20min后，在4℃条件下5000r/min离心20min，收集上清液，去除不耐热的杂蛋白，得到对热有一定耐受度的虾类抽提液，并进行冷冻干燥，得到热耐受虾蛋白粉末。(3)饱和硫酸铵分级沉淀按照硫酸铵浓度分配表，配制饱和度为30％的硫酸铵溶液，向其中加入热耐受虾蛋白粉末20g，4℃磁力搅拌2h、静置4h，并在4℃条件下5000r/min离心20min后，取上清液。向上清液中加入硫酸铵至饱和度达到45％，在4℃条件下磁力搅拌2h、静置4h，并在4℃条件下5000r/min离心20min，收集沉淀，用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液复溶。(4)原肌球蛋白特异性IgG抗体亲和层析将收集的蛋白组分装入透过分子量为2000的透析袋，用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液于4℃透析48h，然后用固定有原肌球蛋白特异性IgG的Sephrose亲和层析柱进行纯化，条件为：将柱体积10％的虾蛋白溶液加入柱子，在4℃条件下平衡2h，然后采用含有1M NaCl的0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液进行洗脱，流速为0.2mL/min，每2min对洗脱液进行分部收集，在280nm和260nm进行紫外吸收检测，收集所需的样品，合并后在4℃条件下用去离子水透析24h，样品经冷冻干燥后即为虾原肌球蛋白的基准物质。