[发明专利]检测植物感染番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA和组织印迹ELISA方法及其试剂盒及应用

摘要

本发明公开了检测植物感染番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA和组织印迹ELISA方法及其试剂盒及应用。利用针对番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白制备的单克隆抗体，建立配比最优化的斑点酶联免疫吸附法（dotenzyme-linkedimmunosorbentassay，dot-ELISA）及组织印记ELISA的方法，并研发快速检测试剂盒。该发明适用于番茄、辣椒、茄子、烟草、龙葵、曼陀罗等茄科植物。利用该发明可对田间蔬菜样品番茄黄化曲叶病毒感染情况进行调查，检测病毒病的发病率，评估番茄黄化曲叶病毒在田间的发生分布情况及流行爆发趋势。该检测方法灵敏度高、特异性好、耗时短、成本低，为番茄黄化曲叶病毒的快速、大规模检测提供技术支撑。

主权项

一种检测植物感染番茄黄化曲叶病毒的dot‑ELISA快速鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：1）硝酸纤维素（NC）膜准备：用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格1×1 cm，在NC膜的一角做标记，平整放入培养皿中央；2）植物样品处理：按重量体积比1: 30至1: 50（克/毫升）比例称取植物茎干，加入0.01 mol/L PBS将植物组织研磨成匀浆状；3）点样：用移液枪吸取2 ul植物上清液点到划好的格子中央；4）封闭：点样后，将NC膜静置晾干10分钟，使用按5 g脱脂奶粉加100 mL PBST缓冲液的比例配制得到5%的脱脂奶粉封闭，37℃静置0.5‑1小时，所述的PBST缓冲液含0.05% Tween‑20的0.01 mol/L PBS； 5）加一抗：加入中国专利申请号为201210004197.7的番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体用5%的脱脂奶粉1: 2000倍稀释，37℃孵育1小时；6）洗涤：弃液体，NC膜用PBST缓冲液摇动洗脱3次，每次3分钟；7）加酶标二抗：弃洗脱液，加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG二抗，二抗用5%的脱脂奶粉1: 8000倍稀释，37℃孵育1小时；8）洗涤：弃液体，NC膜用PBST缓冲液摇动洗脱5~6次，每次5分钟；9）显色：显色底物NBT 66 ul和BCIP 33 ul加到10 ml底物缓冲液中混匀，洗好的NC膜用滤纸吸干后放入底物显色液中反应10分钟； 10）终止反应：待NC膜上的样品呈现紫色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应；11）记录结果：ddH2 O浸泡NC膜，晾干后记录结果。