[发明专利]一种基于串联多内对照的检测拷贝数变异的方法

摘要

本发明涉及基于通用荧光引物的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，包括下列步骤：（1）提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测区段和至少一对位于参照区段的嵌合特异引物组成；（2）构建一个全长内对照序列，通过限制性内切酶消化获得所有内对照片段；（3）多重竞争性PCR反应过程；和（4）数据分析。本发明还提供基于以上分析方法的试剂盒，适用于5~28个基因/反应的拷贝数变异的检测，是一种快速、中通量、经济的拷贝数变异检测方案。

主权项

一种多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，包括以下步骤： （1）提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测区段和一对 位于参照区段的上下游嵌合特异引物组成： 所述通用荧光引物长度范围为10~25bp，5’端用荧光标记，TM值≤57℃值，且通用引物对待测基因组具有特异性； 所述嵌合特异引物针对待测区段和参照区段设计，TM值≥62℃，长度范围为28~50bp，3’端为18~25bp的特异引物序列，5’端为所述通用引物序列，所述3’端和5’端的序列之间插入两个碱基的固定组合；所有嵌合特异引物之间的TM值的差异不超过3℃；（2）所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段之间有可检出的长度差异； （3）提供一种全长内对照DNA，其序列特征在于：所述的全长内对照含有待测区段和参照区段的引物间所有序列，每条全长内对照序列含串联的至少1个拷贝的待测区段和至少1个拷贝的参照区段，除了在每个内对照区段序列的非引物区增加或减少1‑5个任意碱基使得所述的内对照序列比待测区段和参照区段长或短1‑5个碱基外，每个内对照序列与待测区段和参照区段分别完全一致；相邻的内对照区段间和所述全长内对照的两侧均有限制性内切酶的酶切位点，且所述的酶切位点不存在于任何一个内对照序列中；使用时，将定量后的全长内对照DNA用限制性内切酶充分消化后，获得独立的内对照片段，定量稀释后获得内对照稀释液； （4）多重竞争性PCR反应： (a)将含待测区段和参照区段的待测样本和对照样本分别与相等或整数倍摩尔数的内对照稀释液混合在一起，然后进行PCR，在前3~16个循环中，退火温度高于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述嵌合特异引物引导的扩增，在后17~20个循环中，退火温度低于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述通用荧光引物引导的扩增，且两组退火温度的差距≥5℃； (b)根据荧光标记PCR扩增产物长度不同，对扩增产物片段进行检测，获得待测样本中待测区段和参照区段以及内对照扩增产物片段的长度信息与相应的荧光强度信息； （5）数据分析 i.计算每个待测区段和参照区段的样本峰高和/或峰面积（S）和内对照的峰高和/或峰面积（I），得到每个待测区段和参照区段的比值（S/I）； ii.以一个参照区段的比值为标准，将所有待测区段和参照区段的比值同其作比，进行数据内部标化； iii.按照i和ii的步骤将对照样本进行数据内部标化； iv.将待测样本和对照样本的内部标化值作比，获得待测样本与对照样本的比值，该比值乘以对照样本的拷贝数，得到待测样本的拷贝数。