[发明专利]一种牡蛎鳃部菌群的PCR-DGGE分析方法

摘要

本发明涉及一种牡蛎鳃部菌群的PCR-DGGE分析方法。所述方法包括DNA提取、巢式PCR扩增、变性梯度凝胶电泳DGGE、对DGGE指纹图谱进行聚类分析；其中所述DNA提取的步骤为：（1）取牡蛎鳃部组织经生理盐水震荡、过滤，取滤液离心，去沉淀，清液离心，收集菌体；（2）菌体样品经裂解、抽提、异丙醇沉淀和乙醇洗涤；本发明是以牡蛎为研究对象，解决传统分离培养方法应用于研究微生物所带来的不足，该方法可以用于保鲜或者养殖过程中牡蛎鳃部主要菌群的分析，可避免传统分离培养的耗时大，工作繁重，操作繁琐，实现对含高蛋白的牡蛎样品中菌群总DNA的高效提取、有效扩增以及菌群微生态准确分析。

主权项

一种牡蛎鳃部菌群的PCR‑DGGE分析方法，其特征在于：所述方法包括DNA提取、巢式PCR扩增、变性梯度凝胶电泳DGGE、对DGGE指纹图谱进行聚类分析；其中所述DNA提取的步骤如下：（1）取牡蛎鳃部组织1～5g，剪碎后，加入50mL的生理盐水中，150rpm震荡20min，200目绢布过滤，取滤液800rpm离心10min，去沉淀，清液8000rpm离心10min，收集菌体重悬浮于TE中，‑20℃保存备用；（2）菌体样品经裂解、抽提、异丙醇沉淀和乙醇洗涤，所得DNA沉淀溶解于TE，‑20℃保存备用；步骤（2）所述的裂解采用溶菌酶和SDS：首先在菌体样品中加入20～100μL 10mg/mL的溶菌酶，37℃保温1h，然后依次加入100μL 10% SDS和0.3～0.5mg蛋白酶 K干粉，55℃保温1h；步骤（2）所述的抽提参数为：氯仿:异戊醇v/v=24:1抽提，2000～5000rpm离心5～10min，上清用酚:氯仿:异戊醇v/v=25:24:1抽提，3000～8000rpm离心5～10min，上清用氯仿:异戊醇v/v=24:1再次抽提，10000 rpm离心5～10min，吸取上清，用于异丙醇沉淀。