[发明专利]一种生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（NVDC-JXA1株）的方法及其应用

摘要

本发明提供了一种生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（NVDC-JXA1株）的方法及其应用，包括如下步骤：（1）用微载体培养制苗用细胞；选择生物反应器；（2）制苗用毒液的繁殖与收获；（3）疫苗配制；（4）成品检验。该方法生产的疫苗，污染机率低，病毒滴度高（其毒价可提高2～5倍），批间差异小，产品质量稳定，副反应小，能全面提升疫苗质量。

主权项

一种生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（NVDC‑JXA1株）的方法及其应用，其特征在于，包括如下步骤：（1）用微载体培养制苗用细胞：选择生物反应器；选择球形微载体作为细胞贴附生长的载体；选择Marc‑145细胞作为制苗用细胞；将Marc‑145细胞经胰酶消化液消化传代，用配方为含7%～10%胎牛血清的DMEM培养基、pH调整为7.2的细胞生长液继续培养，培养温度为37℃，形成良好单层时，取转瓶上生长良好的Marc‑145细胞，经胰酶消化液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按每个微载体添加5～20个细胞的比例接种到含有细胞生长液与微载体的生物反应器中；生物反应器设定如下参数：温度37℃、pH值6.8～7.4、溶氧含量40%～60%、搅拌速度30～55rpm、CO2 通气量5～10%，进行反应器自动控制培养;    （2）制苗用毒液的繁殖与收获：培养后48～72小时待观察到微载体上细胞基本长满形成致密单层时，去掉细胞生长液，加入1/4～1工作体积的配方为含2%～5%胎牛血清的DMEM培养基、pH调整为7.2的细胞维持液；将猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC‑JXA1株种毒按照感染复数M.O.I.为0.0001～1.0的比例接种生长良好的上述细胞单层， 37℃孵育1～10小时，然后向生物反应器中补足生物反应器正常工作所需要的培养基，并设定如下参数：温度37℃、pH值6.5～7.2、溶氧40%～60%、搅拌速度30～45rpm、CO2通气量 5～10%，进行反应器自动控制培养;接毒后每隔2小时取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况，待观察微载体上细胞基本全部脱落、细胞病变达到80%以上时，停止反应器的搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，分别收获上清液和微载体；反复冻融2次，经离心或过滤除去细胞碎片，‑20℃以下保存作为半成品；按《中国兽药典》附录对半成品进行无菌检验及病毒含量测定，病毒含量应不低于106.0TCID50/ml；    （3）疫苗配制：将检验合格的病毒液按终浓度为0.1%比例加入甲醛溶液，混匀，置37℃灭活18小时取出，置2～8℃保存；灭活检验合格后，取灭活病毒液96份，加入高压灭菌冷却后的吐温‑80 4份，充分搅拌，直至吐温‑80完全溶解，制得水相;取注射用白油94份、司本‑80 6份混合后加热，再加入硬脂酸铝2份，随加随搅拌到透明为止，高压灭菌，制得油相；取油相1.5份置乳化灌中搅拌，再缓慢加入水相1份，加完后再以3000r/min搅拌30～60分钟，使混合物充分乳化，制成猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（NVDC‑JXA1株）；    （4）成品检验：按农业部审批通过的《猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（NVDC‑JXA1株）制造及检验试行规程》要求进行检验，各项指标均符合规定。