[发明专利]一种鉴定油葵康地4号品种纯度的方法

摘要

本发明公开了一种鉴定油葵康地4号品种纯度方法。通过建立了油葵RAPD技术最佳程序，并确定了PCR扩增反应各组分的优化组合，以商品油葵品种康地4号及其双亲的DNA为模板，进行大量随机引物分子标记的筛选和重复，获得了鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的引物标记OPB03，扩增的康地4号产生的母本特异标记OPB03条带大小为480bp，产生的父本特异标记OPB03条带大小为900bp；杂交种的DNA片段中包含父母本的特征谱带，这个引物标记可有效用于鉴定上述油葵杂交种种子的纯度，辨别种子的真伪，利于油葵杂交种种子高效准确的质量控制，加快油葵商品种子的质量检测进程，具有重要应用价值。

主权项

一种鉴定油葵康地4号品种纯度的方法，其特征在于，具体鉴定方法步骤如下：（1）油葵DNA提取：取培养2周的油葵幼嫩真叶于研钵中,加入液氮迅速研磨使成均匀粉状,在样品未融化之前加入65℃预热的CTAB提取液500μl,充分混匀后把样液移入1.5 ml离心管中,置65℃水浴50 min,其间颠倒离心管数次；取出样品冷却至室温,分别加入等体积的酚/氯仿和氯仿/异戊醇进行抽提,其中，酚/氯仿按体积比1：1计，氯仿/异戊醇按24∶1计，经4℃12 000 r/min离心5 min；取上清液加入0.6倍体积的异丙醇混匀,于室温放置5‑10 min, 12 000 r/min离心5 min,去上清,用100μl 70%乙醇洗涤沉淀,置无菌台吹干；用双蒸水溶解DNA沉淀,4℃保存备用；CTAB提取液为：50 mmol/L Tris‑HCl pH8, 0.7 mmol/L NaCl,10 mmol/L EDTA, pH 8, 1% CTAB, 20 mmol/L 2‑巯基乙醇；（2）PCR扩增反应及程序：反应总体积为20ul, 其中含10×反应缓冲液，1.25mmol/L MgCl2, 1u Taq DNA 聚合酶，0.1mmol/L dNTPs, 1umol/L Primer, 1‑5ng模板DNA；扩增程序为94℃ 预变性4min; 94℃ 变性20sec, 37℃ 退火 50sec, 72℃ 延伸 1min20sec, 40个循环后再于72℃ 延伸10min；（3）胶板的制备：待0.5%琼脂糖胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，电泳缓冲液50×TAE Buffer 配制方法： 称量Tris 242g，Na2EDTA·2H2O 37.2g 溶于1L烧杯中，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；（4）电泳、观察和拍照：取4ml上述步骤(2)PCR扩增反应液加样缓冲液1ml，加样缓冲液为：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40克蔗糖定容至100ml；加样后的凝胶板立即通电进行电泳，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳；电泳完毕，取出凝胶；在波长为254nm的紫外灯下观察染色后的电泳胶板；DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带，于凝胶成像系统中拍照并保存之；（5）上述步骤以商品油葵品种康地4号及其双亲的DNA为模板，进行大量随机引物分子标记的筛选和重复，获得了鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的随机引物标记OPB03，该引物序列CATCCCCCTG。