[发明专利]苹果种质资源改良TP-M13-SSR分子标记方法

摘要

本发明提出的是苹果种质资源改良TP-M13-SSR分子标记方法。不同SSR分子标记引物合并到同一体系，并将两次PCR程序合并为一次，减少操作步骤，最大限度的减少人为实验误差，进一步的提高实验效率。用96孔PCR板或384孔PCR板，四色荧光标记的PCR产物可同时在毛细管电泳仪上检测，改良之前一次能够检测384×4共计1536个样品，而现在一次最多可检测384×3×4共计4608个样品，一次可多检测3072个样品。进一步地提高TP-M13-SSR荧光标记分析通量，并且减少了操作步骤，最大限度地减少了因检测流程较多而造成的实验误差。适宜作为苹果种质资源分类的试验应用。

主权项

苹果种质资源改良TP‑M13‑SSR分子标记方法，利用毛细管电泳仪，将毛细管电泳技术和荧光标记技术相结合，不同SSR分子标记引物合并到同一体系，并将两次PCR程序合并为一次，建立改良TP‑M13‑SSR分子标记方法，其特征是：实验步骤：1）、提取苹果基因组DNA，并稀释到20 ng/μL；2）、SSR荧光标记反应：（1）TP‑M13‑SSR反应体系： 模板DNA：2.0ul；Mg2+（25mM）：1.62ul；TP‑M13‑SSR引物1：P‑Primer（2uM）：1.2 ul；F‑Primer（2uM）：0.12 ul； TP‑M13‑SSR引物2：P‑Primer（2uM）：1.2 ul；F‑Primer（2uM）：0.12 ul；TP‑M13‑SSR引物3：P‑Primer（2uM）：1.2 ul；F‑Primer（2uM）：0.12 ul； 同一荧光标记的M13接头：1.8 ul；Buffer(10×)：2.25ul；dNTP(25 mM)：0.18 ul；Taq(5u/ul)：0.24 ul；ddH2O：2.95 ul；Total：15 ul；（2）PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，An.T退火30s，72℃延伸45s，30个循环；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，16个循环；72℃延伸10 min；4℃保存；不同引物扩增所需要的An.T即退火温度不同，因此需要经过实验确定在同一体系中的三对引物具有相同的退火温度；三对具有相同退火温度的TP‑M13‑SSR引物与同一荧光颜色的M13接头在15 ul的反应体系中，采用两套循环的一次PCR反应，在PCR仪上进行扩增，从而实现一次PCR反应三对TP‑M13‑SSR引物的PCR扩增及同一颜色的荧光标记；3）、TP‑M13‑SSR标记的荧光检测：TP‑M13‑SSR扩增产物经过纯化，不同荧光颜色标记的PCR扩增产物在毛细管电泳仪上进行毛细管电泳检测；4）、数据分析：电泳结束后，得到数据利用Genescan和Genotyper两套软件进行分析，自动获取所有数据，最后得到所有样品的毛细管电泳图谱，即SSR指纹图谱，从而完成TP‑M13‑SSR荧光标记。