[发明专利]HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法

摘要

HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，涉及基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。它解决了目前新城疫的病毒疫苗存在成本高的问题。方法：一、以pNDV-F-T为模板PCR扩增，目的片段进行TA克隆及连接，得pTYL-HA-F，酶切得HA-F片段；二、六种质粒分别单酶切及去磷酸化处理，然后进行纯化；三、连接后得六种重组转移载体；四、转化感受态细胞，经提取后得Bacmid-YL；五、转染sf9细胞，得六种重组杆状病毒即完成。本发明利用杆状病毒表达系统，使其直接在中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1内表达HA-F抗原蛋白；为制备鸡新城疫基因工程疫苗奠定了基础，以此制备的新城疫病毒疫苗成本可有效降低。

主权项

HA‑NDV‑F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于HA‑NDV‑F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行：一、以质粒pNDV‑F‑T为模板，YL1和YL2为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，然后进行目的片段的TA克隆，所得产物再与pMD18‑T载体连接，连接产物经鉴定后获得质粒pTYL‑HA‑F，然后用限制性内切酶Xho I和Sal I双酶切pTYL‑HA‑F，获得HA‑F片段；二、质粒pLM、pLM‑ITRs、pLM(‑)、pSD、pSD‑ITRs、pSD(‑)分别进行Sal I单酶切，酶切后获得线性载体质粒pLM、pLM‑ITRs、pLM(‑)、pSD、pSD‑ITRs、pSD(‑)，然后在分别进行去磷酸化处理，获得去磷酸化后线性片段pLM、pLM‑ITRs、pLM(‑)、pSD、pSD‑ITRs、pSD(‑)，再用PCR纯化试剂盒进行纯化；三、用T4连接酶将HA‑F片段与去磷酸化后线性片段pLM、pLM‑ITRs、pLM(‑)、pSD、pSD‑ITRs、pSD(‑)分别进行连接，六种连接产物经鉴定后获得六种重组转移载体，分别为pYL‑LM、pYL‑LM‑ITRs、pYL‑LM(‑)、pYL‑SD、pYL‑SD‑ITRs和pYL‑SD(‑)；四、将六种重组转移载体分别转化E.coli DH10 Bac感受态细胞，经蓝白筛选后挑取白色单菌落，然后提取九种重组Bacmid DNA，统称为重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid‑YL；五、利用脂质体介导转染法将重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid‑YL转染sf9细胞，获得六种重组杆状病毒vYL‑LM、vYL‑LM‑ITRs、vYL‑LM(‑)、vYL‑SD、vYL‑SD‑ITRs和vYL‑SD，即完成HA‑NDV‑F基因重组杆状病毒表达载体的构建；其中步骤一中引物YL1序列为5’‑ATATCGATATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGGGCTCCAGACCTTCTACCAAGA‑3’；引物YL2序列为5’‑CGGGTCGACTCACATTTTTGTAGTGGCTCTCATCTGATC‑3’。