[发明专利]海产品中简单异尖线虫的TaqManPCR检测法

摘要

本发明提供的海产品中简单异尖线虫的TaqMan PCR检测法，具体地讲是TaqMan实时荧光定量PCR检测法，其中扩增反应体系中使用的上游引物为5’-gca cat tgc gct atc ggg ttc att-3’，下游引物为5’-ttg ctt gcc gaa tgc ttc acagtc-3’，荧光标记的TaqMan探针为5’-(FAM)tgg ctg agg gtc gaa tt cgg tga a(TAMRA)-3’。而反应体系所用引物、探针及其他试剂可另行以试剂盒包装成品。与现有技术相比，定量准确；检测速度快，仅需1～1.5小时；方法简单，操作简便；重复性好；特异性强。

主权项

海产品中简单异尖线虫的TaqMan PCR检测法，具体测定步骤如下：(a)用定量标准品制备标准样本，即将定量标准品以一定拷贝数浓度梯度规律制作为成系列工作浓度的标准样本；(b)用DNA提取试剂盒从待测标本中提取总DNA作为待测样本；(c)取(a)步所得各工作浓度标准样本为阳性模板和待测样本为目标模板分别加入到各自包含PCR反应体系的试管中，同步进行荧光定量PCR检测；(d)对各工作浓度标准样本测定出的Ct值与浓度对数值，即log[阳性模板拷贝数浓度]作出标准曲线，将待测样品测出的Ct值从标准曲线中找出log[目标模板拷贝数浓度]值，求出其反对数，即为简单异尖线虫细胞核糖体DNA拷贝浓度；其特征是：其中荧光定量PCR反应体系为2×Premix Ex Taq 10μl、无菌双蒸水6.8μl、10μM上游引物0.4μl、10μM下游引物0.4μl、5μM TaqMan探针0.4μl、模板2.0μl，反应总体积20μl，其中模板即为(c)步中加入的阳性模板或目标模板；所说上游引物、下游引物和定量标准品分别根据简单异尖线虫细胞核糖体DNA内转录间隔区基因不同片段设计合成；所说PCR检测时，其荧光定量PCR反应的扩增条件是以预变性95℃30s；变性95℃5s、退火延伸60℃30s为一个循环，共进行40个循环；温度变化速率选择20℃/s；荧光信号收集在60℃收集；收集方式设为单点收集；仪器检测通道选择“F1”。