[发明专利]一种静注人免疫球蛋白的制备工艺

摘要

本发明涉及一种静注人免疫球蛋白的制备工艺，属于生物制药领域。在静注人免疫球蛋白制备工艺过程中，采用辛酸及氯化钙沉淀法处理静注人免疫球蛋白制备工艺中的组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，去除组分Ⅱ+Ⅲ沉淀中的杂蛋白，再进行两步层析工艺。本发明与通常辛酸沉淀法相比，加入了氯化钙有效地去除了组分Ⅱ+Ⅲ沉淀溶解液中的各种凝血因子，同时提高了免疫球蛋白的稳定性，产品得率显著提高，可至每升血浆7克以上；采用2种不同离子交换柱及层析技术进行上柱层析纯化，能够有效地去除杂蛋白，产品纯度达到99.5%以上。此外加入辛酸及采用DV20滤芯除病毒过滤，能够显著提高去除病毒的效果，提高临床用药的安全性。

主权项

一种静注人免疫球蛋白制备工艺，它采用辛酸及氯化钙沉淀法去除杂蛋白及凝血因子类物质，再进行两步层析工艺，其特征在于制备工艺如下：(1)、将检疫期检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度不大于4L/min/台，出液温度控制在0～4℃；分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，使蛋白液的温度控制在1～3℃之间，按不超过1.0L/min的流速加入pH 4.0醋酸缓冲液调节蛋白液pH值为6.80～7.00；加－15℃或更冷的95％乙醇，流速不超过1.5L/min，使乙醇体积比终浓度至8％，温度控制在－1～－3℃，加完乙醇后pH值为6.80～7.20；(2)、将步骤(1)的制得物搅拌30min以上，进行离心，离心过程中出液流速不超过4L/min/台，出液温度控制在－1～－3℃，离心得组分I沉淀和组分Ⅰ上清蛋白液；组分I沉淀存放于冷库或直接用于纤维蛋白原生产；(3)、将步骤(2)的制得物组分I上清蛋白液加入pH 4.0醋酸缓冲液调节pH值为6.60～6.65；加－15℃或更冷的95％乙醇至乙醇体积比浓度为22％，温度控制在－4～－6℃；搅拌120min以上后，静置60min以上，再开启搅拌，按每升反应液加入18±0.5g硅藻土，进行压滤，进液压力最高不超过0.20Mpa，压滤得组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液，组分Ⅱ+Ⅲ上清液用于人血白蛋白生产；(4)、将步骤(3)的制得物组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，加入8±2℃的10～12倍量的注射用水溶解，再向溶解液中加入氯化钙,使溶解液钙离子浓度为0.2±0.01mol/L；加完搅拌30±5min；然后在搅拌过程中缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为4.5±0.2，缓慢加入辛酸，按每升溶解液中加入浓度为98.5%辛酸40±1毫升，加完搅拌60±5min后进行压缩过滤，过滤压力不超过0.2 Mpa，收集压滤液； (5)、再进行两步层析工艺，两步层析工艺为：①对步骤(4)的制得物压滤液进行超滤，将蛋白含量浓缩至5%以上，用5±0.5倍体积2～8℃注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至3%～6%，用pH4.0醋酸缓冲液调pH至4.0～4.5，然后加磷酸－NaOH缓冲液调节电导率在T=19℃时测为0.21 s / m～0.25s / m，所述的磷酸－NaOH缓冲液中磷酸与NaOH均为1mol/L，调节好后用Macrocap‑Q离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第一步流穿液；②将收集第一步流穿液再进行超滤，将蛋白含量浓缩至5%以上，用5±0.5倍体积2～8℃注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至3%～6%，用0.5±0.1mol/L的NaOH调pH至6.8～7.0，然后加所述的磷酸－NaOH缓冲液调节电导率在T=19℃时测为0.15 s / m～0.17s / m ，调节好后用DEAE‑FF离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第二步流穿液；(6)、用1mol/L的HCl调节步骤(5)的制得物第二步流穿液，pH为3.8～4.0，开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5%以上, 用5倍体积2～8℃注射用水进行透析，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将麦芽糖加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量10%±1%，pH为3.8～4.4，蛋白含量5.5+0.5％；(7)、步骤(6)的制得物经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；所述的百分数除有限定之外，其余为质量百分数。