[发明专利]一种从动物粪便中提取高分子量基因组的方法

摘要

本发明是一种从动物粪便中提取高分子量基因组的方法。包括样品处理、菌体细胞裂解和抽提DNA。用无菌PBS缓冲液溶解动物粪便样品，通过低速离心和过滤去除粪便中的食物残渣，收集菌体细胞，采用溶菌酶+消色肽酶+蛋白酶+SDS对菌体进行破壁，再经酚、氯仿、异戊醇混合液及氯仿、异戊醇混合液抽提，异丙醇及醋酸钠沉淀、洗涤干燥、溶解后用RNA酶消解RNA。本发明操作简单，提取的基因组DNA分子量达到40kb以上，可满足微生物分子生态多样性、分子鉴定、目的基因扩增及构建宏基因组文库等的研究。

主权项

1.一种从动物粪便中提取高分子量基因组的方法，其特征在于按以下步骤进行：（1）样品处理：用无菌PBS缓冲液溶解收集的动物粪便样品，彻底混匀后先低速离心去除大的食物残渣，然后依次用孔径为100μm、70μm、40μm的灭菌细胞过滤器进行过滤，并用PBS缓冲液对截留在滤网上的杂质进行多次冲洗；滤液置于离心机中离心，收集菌体；菌体依次用PBS缓冲液和TE缓冲液洗涤、离心收集菌体，用TE缓冲液悬浮菌体；（2）菌体细胞裂解：向菌体悬浮液中加入高浓度的溶菌酶至终浓度15mg/ml，轻柔混匀后37℃水浴1h；加入消色肽酶至终浓度3mg/ml，轻柔混匀后37℃水浴30min；加入蛋白酶K至终浓度2mg/ml，轻柔混匀后55℃水浴5min；加入浓度为10%的SDS，轻柔混匀后55℃水浴1h；（3）抽提DNA：在上述处理后的细胞裂解液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液，轻柔混匀后离心收集上清液；加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，轻柔混匀后离心收集上清液；加入1倍体积异丙醇、1/10体积醋酸钠，轻柔混匀后室温沉淀30min以上；离心收集沉淀，用浓度为70%的乙醇洗涤沉淀，离心后收集沉淀；沉淀置于室温或真空干燥后，用TE或无菌去离子水溶解，并用RNA酶37℃水浴30min消解去除RNA，即为基因组DNA提取液。