[发明专利]一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法

摘要

本发明公开了一种一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法，采用Langendorff灌注装置经主动脉逆行灌流，依次用含钙液、无钙EGTA液、Ⅱ型胶原酶液灌流，收集Ⅱ型胶原酶循环液加入10%BSA溶液，将心室置于其中恒温摇床震荡消化，用吸管吹打循环液至消化完全得消化液，过滤，滤液自然沉降，收集细胞沉淀，悬浮在酶洗脱液中重复沉降即得心肌细胞，该方法获得的大鼠心肌细胞中75-93%都具有活性，每只大鼠心脏的活细胞产量最高可达约（5-8）×108个，本发明采用单一消化酶分离心肌细胞并用逐步梯度复钙法沉降，既简化了实验步骤，又大大提高了心肌细胞的存活率，简单经济，是分离成年大鼠心肌细胞行之有效的方法。

主权项

一种一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）装置预处理：设置Langendorff灌注装置恒温于37℃，消毒，超纯水灌流，预充灌注母液；（2）灌流：将成年大鼠离体心脏挂于Langendorff灌注装置上，经主动脉逆行灌流，设置灌注流量为6‑10ml/min，用含钙液灌流1‑2min，然后用无钙EGTA液灌流4‑5min，再用Ⅱ型胶原酶液单向灌流1.5‑2.5min，之后循环灌流10‑18min；（3）消化：剪下心室肌组织，弃去心房和大血管，收集Ⅱ型胶原酶循环液，加入10% BSA溶液至BSA终浓度为8‑12mg/ml，取5‑10ml，将心室置于其中，37℃、130‑160次/min恒温摇床震荡消化5‑8min，用吸管吹打循环液至消化完全得消化液，从灌注Ⅱ型胶原酶液开始，每4分钟加入0.1mol/L的CaCl2溶液45‑55μl，共4次；（4）沉降：用160目滤网过滤消化液，滤液自然沉降15‑20min，收集细胞沉淀，悬浮在30ml酶洗脱液中，再自然沉降15‑20min，如此重复洗涤2‑3次，所得自然沉降物即为心肌细胞；（5）前述步骤中所用的试剂为：灌注母液：NaCl 130 mMol/L、KCl 5.4 mMol/L、HEPES 5 mMol/L、D‑Glucose 10 mMol/L、MgCl2·6H2O 3.5 mMol/L、NaH2PO4 0.4 mMol/L，用O2和CO2体积比为95:5的混合气饱和15min，NaOH调节pH至7.20～7.35；10%BSA制备：100mg/mlBSA溶解在含80 mMol/L Ca2+的灌注母液中，在4℃条件下搅拌混匀，放入含80 mMol/L Ca2+的灌注母液中4℃透析1h，换新鲜含80 mMol/L Ca2+的灌注母液，在4℃下静置过夜，然后分装，储存在‑20℃备用；含钙液：在灌注母液中加入CaCl2，使Ca2+终浓度为500‑750 mMol/L；无钙EGTA液：在灌注母液加入EGTA，使EGTA终浓度为100 mMol/L；Ⅱ型胶原酶液：取灌注母液加入Ⅱ型胶原酶和CaCl2，使Ⅱ型胶原酶和Ca2+浓度分别为0.02‑0.06%（质量）和60‑90 mMol/L；酶洗脱液：灌注母液中加入10%BSA和CaCl2，使BSA和Ca2+终浓度分别为1mg/mL和80‑100 mMol/L。