[发明专利]一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法

摘要

本发明公开了一种悬钩子属原位杂交方法，包括制片、制备探针、杂交前预处理、制备杂交液、制片变性、杂交和检测七个步骤。其中，制片采用根尖压片法，制片前处理时用2％纤维素酶和2％果胶酶在37℃下酶解细胞壁1.5h，探针采用单色标记，杂交前杂交液需在100℃变性5min，杂交时在37℃温育18h。本发明所述的杂交方法能有效消除背景干扰，提高检测灵敏度和准确性。本发明适用以45S rDNA、5S rDNA和悬钩子属植物基因组为探针的悬钩子属植物的染色体原位杂交。

主权项

一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制片：取悬钩子根尖，预处理，固定，然后用1mol·L‑1 HCl在60±0.5℃下解离40s，压片，液氮冻片，干燥；2)制备探针：提取选自悬钩子植物基因组DNA或通过PCR，得到目的片段45S rDNA或5S rDNA，用荧光素进行标记，制得探针；3)杂交前预处理：依次用2％纤维素酶和2％果胶酶混合液、100μg·mL‑1的DNase‑free RNaseA、1mg·mL‑1的蛋白酶K和45％醋酸处理，再用4％多聚甲醛固定，然后依次用75％、95％、100％乙醇脱水，晾干；4)制备杂交液：杂交液总体积为30μL：100％去离子甲酰胺15μL；50％硫酸葡聚糖6μL；20×标准柠檬酸盐3μL；10％十二烷基磺酸钠1μL；荧光素标记的探针3μL；封阻DNA1μL；不足30μL时用灭菌的去离子水补足；将杂交液混匀，于100℃变性5min，转入冰上处理至少10min；5)制片变性：将制片于70％甲酰胺中70℃变性3min，转入经‑20℃冰冻的75％、95％、100％乙醇脱水，晾干；6)杂交：将杂交液滴于制片上，加盖玻片，封片，于37℃细胞恒温培养箱中杂交过夜；7)检测：用标准柠檬酸钠盐洗脱，然后加与标记用的荧光素匹配的抗体衬染，观察荧光信号，采集并加工杂交图像。