[发明专利]可作为分子标记的山羊COXⅡ基因片段的筛选方法及其应用

摘要

本发明公开了一种山羊COX II基因片段的筛选方法及其应用。该筛选方法以构建的山羊精子池DNA为模版，利用设计的特异性引物P1在Tag DNA聚合酶、buffer、Mg2+、dNTPs存在的情况下，设定相应的程序，PCR扩增COX I I基因。根据琼脂糖凝胶电泳图判定目的片段大小。测序获得序列及突变位点信息，结果显示扩增产物存在1个碱基的突变。利用限制性内酶切酶HindI II消化P1扩增产物后，再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的扩增片段。通过对P1的扩增产物进行基因型和基因频率分析，以及与安徽白山羊、波尔山羊的精子活力之间进行关联分析，表明COX II基因由引物P1检测的SNP位点可作为山羊精子活力性状选择的分子标记，为山羊精液品质性状标记辅助选择提供分子标记。

主权项

一种可作为分子标记的山羊COX II基因片段的筛选方法，其特征在于，包括下列步骤：(1)构建山羊精子基因组DNA池，并以此池DNA为模版，利用设计的特异性引物P1在TagDNA聚合酶、buffer、Mg2+、dNTPs存在的情况下，PCR扩增COX II基因；所述引物P1如下：正向引物：5’‑CGGTCTGAACTATCTTAC‑3’反向引物：5’‑GAACGTCTTCGGAAGAGA‑3’所述PCR扩增条件：50ng/ul基因组DNA模板1.0ul，25mmol/L MgCl21.5ul，2.5mmol/L dNTP0.5ul，引物(10pmol)各0.8ul，10×反应缓冲液2.0ul，0.4ul Taq DNA聚合酶(5U)，用超纯水补足20ul；所述PCR反应程序如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环，72℃延伸8min，最后4℃保持8min；(2)根据琼脂糖凝胶电泳图判定目的片段大小，测序发现该PCR扩增产物在162bp处存在1个A→G的碱基的突变；用限制性内切酶HindIII消化引物P1的PCR扩增产物，并用2％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的扩增片段，进行基因型判定。