[发明专利]胶体金标记Hly基因单克隆抗体测定单核细胞增生性李斯特菌试剂盒

摘要

一种胶体金标记Hly基因单克隆抗体测定单增李斯特菌试剂盒，属于卫生学检验及医学检验技术领域，其特征是：1引物设计、2PCR扩增、3琼脂糖凝胶电泳的反应条件、4切下目的DNA片段、5应用热休克转化法、6SDS裂解法纯化试剂盒制备质粒、7蛋白的诱导表达、8SDS-PAGE电泳、9从SDS-PAGE电泳凝胶中切下所需条带、10胶体金的制备。有益效果是：改进了过去针对单一菌属单一抗原测定的局限性。抗体纯、效价高，提高了敏感度和准确度。对单增李斯特菌进行检测，同ELISA法和PCR法比较，免疫胶体金层析对李斯特菌的检测具有快速、便捷的优点。

主权项

1.一种胶体金标记Hly基因单克隆抗体测定单增李斯特菌试剂盒，其特征是：a、引物设计L.monocytogenes Hly蛋白基因序列根据GenBank中的L.monocytogenes Hly蛋白基因序列，应用Primer Premier5.0，DNA Club和Oligo 6.0设计特异性引物P1和P2，预期扩增长度为1434bp；在NCBI GENEBANK中找到基因序列后，看选择的酶切位点，在所要进行PCR的基因序列中是否存在；用Primer primer5把序列反向互补；在应用Oligo 6.0引物设计时，上下游引物全长输入；上游引物位点的确定为5’端模板第一个碱基前面的所有碱基的负数值+1下游引物位点的确定为下游引物-酶切位点-保护性碱基＝A，序列全长-A+1＝下游引物位点；上游引物5一‘AAGAggatccAGAGTGAAACCCATG一3’；下游引物5一‘GGACctcgagAATTATTCGATTGGATT一3’；为下一步克隆需要，分别在上、下游引物中引入BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点b、PCR扩增PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，扩增32个循环；预期片段大小1 600bp；c、琼脂糖凝胶电泳的反应条件用1.0％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，电压100V，电泳30min；d、切下目的DNA片段，用凝胶快速纯化回收试剂盒回收；将回收纯化的PCR产物与pMD18-T进行连接，并pMD18-T载体16℃12小时以上连接；制备感受态细胞，应用CaCl₂致敏法制备大肠杆菌感受态，接种JM109菌种，37℃，225rpm12小时振摇培养后，菌液在LB固体培养基上划线，37℃孵箱过夜培养，筛选单克隆；选一单菌落接种于5mLLB培养基中，12小时以上培养，培养物按1/100接种于LB培养基中，培养至A₆₀₀达0.45-0.55，用CaCl₂致敏大肠杆菌；e、应用热休克转化法，将连接反应液加入100μL感受状态的细胞中，再加3μl DMSO以增加转化效率，冰浴30min后，42℃休克45s，然后迅速冰浴5min，再将转化产物加入LB液体培养基中复苏30min后，离心收集菌体，将其铺于含筛选抗生素的LB固体培养基上，37℃恒温孵箱放置16h后观察转化效果；f、SDS裂解法纯化试剂盒制备质粒；用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行酶切鉴定及PCR鉴定，筛选出阳性重组质粒，命名为pGEX-6P-1-Hly；用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行亚克隆，表达载体pGEX-6P-1和重组克隆载体pGEX-6P-1-Hly用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ切处理，琼脂糖凝胶电泳，线性表达载体用DNA快速纯化回收试剂盒回收，亚克隆片段用挤胶法回收，亚克隆载体与片段用T4DNA连接酶连接，连接产物转化JM109感受态，提取质粒，鉴定阳性克隆；g、蛋白的诱导表达用pGEX-6P-1重组质粒转化BL21受体菌，选择单克隆接种到5mL LB培养液里，按传统方式诱导表达，即37℃，225rpm振荡培养至A600达0.6-0.8，加IPTG至1mmol/L，对照组不加IPTG，3h后收集细菌；同时接种诱导菌种，提取质粒，BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切验证确含目的片段后，进行测序，测序正确后进行重组蛋白的后续实验；h、SDS-PAGE电泳将诱导后菌液30mL 11000rpm离心2min，弃上清，收集菌体，向菌体沉淀中加入2×SDS凝胶加样缓冲液1000μl，煮沸5min后进行SDS-PAGE电泳；i、从SDS-PAGE电泳凝胶中切下所需条带，大约用两天时间将其冻干，并碾成粉末；用考马斯亮蓝法进行蛋白浓度测定，制作蛋白标准曲线；595nm处比色；将抗原溶于生理盐水中，配制浓度为1μg/μl；免疫BALB/c小鼠；4-6周，加强免疫；小鼠腹水的诱导取10周龄的健康BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，每只0.5ml，7-10天后，收集杂交瘤细胞，离心，去上清，加入不含血清的培养基，调节细胞密度为3×10⁷个/ml，每只小鼠注射1ml；设阴性对照、盐水对照；10天后，小鼠腹部增大，开始收集腹水；用12号针头扎入腹部，挤压，使腹水流出，收集至离心管，并使劲晃动离心管防止腹水凝结；1000转离心5分钟，吸取上清，注意去掉上面一层脂肪；分装，-20℃冻存；j、胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法并稍作改进制备胶体金；胶体金制备，取1％氯金酸溶液2.5ml加入到250ml容量瓶中，加双蒸水至标定刻度线，使氯金酸溶液的浓度为1‰，沸水浴10min，加入1％柠檬酸三钠溶液6.65ml；快速搅拌直至颜色彻底变为紫红色，继续沸水10min，取出；凉至室温后，用双蒸水恢复至原体积；置4℃冰箱保存备用；测定胶体金在515nm波长具有最大吸收峰，确定胶体金直径大小为10nm；胶体金探针制备，取新鲜制备的胶体金溶液50ml，加入0.2mol/L K₂CO3，调pH至8.2，置磁力搅拌器上调适量转速，然后加入适量的已纯化好的抗体；使抗体浓度恰好在稳定蛋白质的最小量上；缓慢搅拌10min，加入牛血清白蛋白BSA，使BSA的终浓度为1％，继续搅拌10min。将上述胶体金一抗体一BSA液进行4000r/min离心20min，收集上清；将收集的上清进行4℃、10000r/min离心60min；弃上清，沉淀用含1％BSA的0.01mol/L。pH7.4PBS悬浮；同上4℃，10000r/min离心60min两次，最后将沉淀用5ml PBS-T溶解；4℃冰箱保存备用；层析试纸条组装试纸条由吸水纤维、硝酸纤维膜、玻璃纤维和PVC板组成；硝酸纤维膜处理，中段相隔5mm分别用羊抗鼠IgG对照线和单核李斯特菌抗体检测线划线，形成两条宽约1mm的线段，干燥后用含1％BSA的PBS封闭过夜，37℃干燥；试纸条组装，取洁净PVC板，将处理好的硝酸纤维膜粘在PVC板中部合适位置；将2cm吸水纤维粘在PVC板上端并部分压在硝酸纤维膜上，0.8cm玻璃纤维粘在PVC板下端并部分压在硝酸纤维膜上，切成宽5mm的条带，即为层析试纸条；干燥剂密封冷冻保存。