[发明专利]一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法及应用，其步骤是：A、芒属植物转录组序列的获得：选取芒属植物的幼嫩叶片，分别提取总RNA，得到转录组Reads，去除载体RNA序列污染，拼接，获得芒属植物转录组序列；B、芒属植物ESR序列中SSR位点的鉴定：采用SSR检索软件对得到的非冗余Unigene-EST序列进行SSR位点查找，重复基序为2-6个碱基，获得一系列含有SSR位点信息的Unigene序列；C、芒属植物Genic-SSR引物的设计：依据得到的含有SSR位点的Unigene序列，采用引物设计软件进行引物设计，获得一系列Genic-SSR引物。方法简单，效率高，操作简便，获得的标记数量巨大，通过转录组测序获得EST序列，为重要能源植物芒草的遗传学研究及分子改良等奠定基础。

主权项

一种芒属植物Genic‑SSR标记的制备方法，其步骤是：1)、芒属植物转录组序列的获得：选取芒属植物的幼嫩叶片，分别提取总RNA，采用转录组测序方法，得到转录组Reads，去除载体RNA序列污染，利用拼接软件完成序列拼接，最终获得芒属植物五个种的非冗余Unigene‑EST序列；2)、芒属植物ESR序列中SSR位点的鉴定：采用SSR检索软件对上述步骤(1)得到的非冗余Unigene‑EST序列进行SSR位点查找，检索的限定条件为：重复基序为2‑6个碱基，且重复单元数依次大于6次，5次，4次，4次，3次；对于中间被≤50bp的间隔碱基打断的复合型SSR计为一个SSR位点，获得一系列含有SSR位点信息的Unigene序列；3)、芒属植物Genic‑SSR引物的设计：依据上述步骤(2)得到的含有SSR位点的Unigene序列，采用引物设计软件进行引物设计，获得一系列Genic‑SSR引物，引物设计参数主要包括：引物长度为18‑25bp，退火温度为50‑65℃，GC含量为45‑65％，PCR扩增产物长度为90‑300bp；4)、芒属植物Genic‑SSR引物的扩增与筛选：选取用于转录组测序的五个材料，用于检测芒属植物Genic‑SSR标记的扩增状况以及可转移性。选取五个材料的幼叶50‑100mg置于2.0mi离心管中，液氮冷却后，用研磨棒迅速将样品碾磨成粉末状，基因组提取利用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒，利用1％质量体积比的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。采用上述步骤(3)合成的引物，以五个材料的基因组DNA进行扩增，以检测引物设计的可靠性、扩增模式及其通用性。根据扩增结果，筛选可有效扩增的芒属Genic‑SSR引物。依据扩增结果，筛选出可以稳定扩增的Genic‑SSR引物60对，具体如下：ms‑It‑1F：CACCAGTGTTGGATGCTGACR：TGTTGTCTAGCCTCCCGTCTms‑It‑2F：ACACTGTCCCAAATCCTTCCR：AAGAAATCTCACTCCTCTCCCCms‑It‑3F：CTCACAGGACAAGAGAGGGGR：GCATTCCAAAAGCATCCAGTms‑It‑4F：TGGAGCTGTGATCCTCTTCCR：CGGCTCAAAAACCACAAAATms‑It‑5F：TCCAATCTAACCTCGTTGCCR：TGAGGTCTCGAACTGCAAAAms‑It‑6F：CACCGTCGAGTAGGGTGGR：CTGACGAGGGCACCAGACms‑It‑8F：ACCGGGGTCAGGAAGTAGAAR：TGTTCGTCTACAACGCCACTms‑It‑9F：CCAGCTTCTCCCACACCCR：CACCGAAGAGCCCCTCTCms‑It‑10F：CTTGCAGTGCCTCCGTATGR：CCTCATCGTCGACTTCAACAms‑It‑12F：AGTGATGGAACTGCTGGAGGR：CTTTGAGCGTCGATCCATTTms‑It‑13F：TGATGGTGTTGGTGATTTGGR：ATTTGCTGTTGCTGCTGTTGms‑It‑18F：TGGCTCCCACTATCACTTCCR：CTTGCTGCAACAGATGGAAAms‑It‑19F：CATGGACTCGGATCAGGACTR：CGAGGAGGAACTTGGTGGATms‑It‑20F：GCAGGTTGCGATCCTAAGACR：GATCACCTGAAAAGGCAAGCms‑It‑21F：CCAAGCTCTAAACAGGCTCGR：GATGGGAGTTTACGTGGGGms‑It‑23F：CAACCTCCTCTCCCTGATGAR：AGACGGAGATGAATCGTTGGms‑It‑24F：CATGGTTGAGTTCTACGCCCR：AGAAGAGGATGGTGGGGAAGms‑It‑26F：GGTCCATGACGAAGTCGAAGR：CCCGGAGTTCTACTGCTACGms‑It‑27F：AAACATGCGTGCTTTGACTGR：TTGCCTCTTTCGTGCTACCTms‑It‑28F：ACCACCAAAACCAAACGAAGR：TAGAGGGGAAGAAGGGGAAGms‑It‑29F：GGTCTAATCGCCCCGTAGATR：CCCTTTACTCCCGAGGAGACmf‑ts‑1F：CAGATGAGACCAGCAGTGGAR：ACGCCAGTCAACCATCTCTTmf‑ts‑2F：ACAGGGAGAGGGGAGAAGAAR：TCCATCGTTTTCTGGTGTGAmf‑ts‑4F：GTGCTCTTCCGCCTGAACTAR：TCCTCCTCCTCACCATCATCmf‑ts‑5F：CAAATGGTCGTCCCAAAGACR：AGAGGAAGAATGGGTGGGAGmf‑ts‑6F：ATGGCTACCACTCAGTTCGCR：GTCGTCGTCCTCTTCAAGGmf‑ts‑9F：ACCGTCCATCCATCTGTAGCR：GCTTCCTGGACGACTCTGTTmf‑ts‑10F：CTCGAGCGAGCTGTTCATTTR：TGAAGATACCGTGGAGGAGGmf‑ts‑11F：CTTGTCCCTCTTCACCAAGCR：CCTTTCTTCCAGTGGCTCAAmf‑ts‑13F：CCAGAGGGATAGGAGGAGGAR：CACGTGTAGCAGGTCCTGAAmf‑ts‑14F：GCTCTCCGAGGTCGTGTCR：CCTGTCTGAGGATGGTCCCmf‑ts‑15F：ACGTCCTTCTTTCTGCTGGAR：CGTCTCTGCTCCTGGCTTTAmf‑ts‑16F：GGAACGGGGAAACCTCTGR：TCTCTTCTCTTCTCCGTCGCmf‑ts‑17F：AAAGGGTACGGCACTGAGGTR：GCAACGTGAACTCTGTCTGCmf‑ts‑18F：GAGGGGATCTAGATGAGGGCR：CCAGCTCGTTTCTTCCTCAGmf‑ts‑19F：CGTCTGCGACACAAGAACATR：ATGATGTTGCTGGCCTTGATmf‑ts‑21F：GGACACCTACACGGTCACCTR：CTGCTGGCTGGTGGTGTTmf‑ts‑22F：CATGGTTGAGTTCTACGCCCR：AGAAGAGGATGGTGGGGAAGmf‑ts‑23F：CGCACAAAAGAATGCATCACR：GGAACGCCACTTTCTAGCACmf‑ts‑24F：ACCAGCACCGTCATCATCAGR：GAACAGGTTGCCGGTGTATCmf‑ts‑25F：CTACGACCGCTGCTGCTAGTR：TCTCCATACTGCTCTGGGCTmf‑ts‑28F：TTCCGATCTCAAGGACCAACR：AACCCTCCTGTCCATGATGAmf‑ts‑29F：CTGCAAGTTTCTTTGCCCTCR：TCTGAAAAGTGGTGGTGTGCmg‑1F：ATCAGAGAGAGGCACCTGGAR：GAGTGAGGAGATGACCCGACmg‑2F：AGAAACGTGAAACCTGCTGAAR：AAGCTGACAGCACAACAACGmg‑5F：GGCGGATAATCAGCAAGTGTR：GAAGAGTGGCTGGGTTGAAGmg‑6F：GGAGAGTGAGAGCAGGGTTGR：GTTGCCACAAATCTGGCTGmg‑7F：ACCAAGACCAAATCTGCCACR：ACACAGCTACATCGGGTTCCmg‑8F：AACTCTTTTACAACGTCAATTTGCR：CAGCCTTTGGTTAGAGCACCmg‑17F：AATAGGAGGCTGGCTGGTTTR：GCAATTTGCTCCTGCACATAmg‑18F：GCAGCAGAGAGGAGAGGAGAR：CCCGTCGTGTTGATGTACTGmg‑19F：TCTCCTCCAGGTTCACCATCR：AGGTGCAAATCATCTACCGCmg‑21F：ACAGGAACGGAGGAACTTGAR：GATACGCCGTCGCTGAAGmg‑22F：GATCGCTCCTTCCATTGTGTR：AATCTCAAGTCCTCCTCCCCmg‑23F：TGAGATTCCTCCCTCCATTGR：GCGCTCTACTCCAGGAAAAAmg‑25F：GCCCCTCAGATGGTTGAATAR：TGTGGTACATCTCCCTGCAAmg‑26F：GTCACTCTCCCCTCCCATTCR：TGCACCCTTTACGAACTCCTmg‑27F：CCATGGCTAAGCCTCACTTCR：GCGCACACACACACACTACTmg‑29F：AGCGTAAGAGGGAGGATGGTR：GGAGCTCCTCCTCGGTGTmg‑30F：TTGACGGTGACGATGAGGTAR：TCAAATCTCATCAGTTCCCAAA所述的芒属植物为芒、五节芒、荻、南荻、奇岗其中的任意一种。