[发明专利]兔抗犬细小病毒2a型多克隆抗体的制备方法

摘要

本发明公开了兔抗犬细小病毒2a型多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：A1，病毒扩增；A2，抗原浓缩；A3，抗原含量测定；A4，免疫接种方法；A5，血清提纯；将CPV-2a毒株纯化后扩增，所获病毒液用PEG6000浓缩、弗氏佐剂乳化后分十点皮下免疫兔只，共基础和加强免疫四次。所制多克隆抗体效价高，HI≥1∶10240，SN≥1∶51200，与CPV-2多抗相比中和CPV-2a的效力更强。

主权项

一种兔抗犬细小病毒2a型多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A1，病毒扩增：F81细胞长满单层后消化传代，分于新瓶中3×106‑3×107个细胞，并按1∶10将CPV‑2a毒株接于F81细胞上；37℃，5mL/L CO2培养箱中静置培养，待细胞贴壁后换培养液，观察5d，若无CPE，则按常规细胞传代方法传代，待出现CPE，反复冻融3次，收取毒液，于‑20℃存放。A2，抗原浓缩：通过PEG6000方法将收集的CPV‑2a毒液进行浓缩；步骤为：11000r/min离心30min，取上清液11000r/min离心20min，上清液加入100g/L PEG6000，22g/L的NaCl，缓慢搅拌均匀，调PH为7.4，于4℃沉淀过夜；次日，10000r/min离心40min，取沉淀用少量PBS混悬，10000r/min离心15min，取上清液过滤，置‑20℃保存；A3，抗原蛋白含量测定：将提纯的抗原通过核酸蛋白分析仪和血凝试验进行蛋白含量测定；A4，免疫接种方法：首次免疫，取CPV‑2a抗原4.5mL与弗氏完全佐剂1∶1乳化，待形成油包水型后，乳化完全；将复合佐剂抗原分为三头份免疫接种3只成年公兔，在腰背处分十点皮下注射；15d后，进行二次免疫，取抗原3mL与弗氏不完全佐剂1∶1充分乳化，免疫方法与首免一致；此后，间隔一周免疫，抗原剂量和二免一致，共基础免疫三次；每次免疫之前，耳缘静脉采血测定效价；若三次免疫后效价结果不理想，则进行加强免疫，取抗原3.5mL与佐剂乳化进行接种，间隔一周加免；当抗体效价不再上升时，颈动脉放血收集血清，‑20℃保存；A5，血清提纯：向血清中缓慢加入2‑3倍体积0.06mol/L的NaAc后，缓慢加入75g/L正辛酸搅拌均匀，于4℃静置1h，10000r/min离心20min，取上清过滤加入100mL/L PBS，缓慢搅拌加入500g/L硫酸铵，4℃静置过夜。次日10000r/min离心20min，用生理盐水稀释沉淀于原血清体积，再次缓慢搅拌加入330g/L硫酸铵，于4℃静置2h后，同上， 离心20min，生理盐水稀释沉淀于原血清体积，放于透析袋中透析；透析后8000r/min离心10min，取上清过滤，置于‑20℃保存。