[发明专利]离子交换层析纯化制备人轮状病毒灭活疫苗的方法

摘要

离子交换层析纯化制备人轮状病毒灭活疫苗的方法，涉及病毒制备灭活疫苗的方法。本发明包括浓缩病毒收获液，经QsepharoseFastFlow离子交换柱层析纯化，纯化产物透析脱盐，过滤除菌灭活等得到人轮状病毒灭活疫苗；进一步进行纯度、总蛋白去除率和感染性滴度检测，并进行抗原性、免疫原性检测及基因组带型稳定性检测。本发明纯化后病毒收获液总蛋白去除率为99.69%，病毒纯化前后感染性滴度分别为4.25lgCCID50/ml和7.0lgCCID50/ml，纯化的病毒灭活后病毒基因组带型未发生变异，保持了良好的抗原性和免疫原性。

主权项

离子交换层析纯化制备人轮状病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：（1）病毒液的制备和浓缩：在Vero 细胞上进行病毒扩增，规模化培养45个转瓶，细胞为致密单层时种毒，细胞密度为：1.33×105个细胞/cm2×850cm2/转瓶 =1.1×108个细胞/转瓶；当病毒增殖72h时收获病毒，经反复冻融3次后，8000rpm离心20min 取上清液收获得到9.8L含有病毒颗粒的病毒原液，病毒原液蛋白含量介于600ug/mL～700ug/mL,病毒感染性滴度为4.0lgCCID50 /mL以上；用截留分子量为100KDa的切向流超滤系统将9.8L病毒原液超滤浓缩36倍至0.27L,以备进入步骤（2）；（2）病毒的纯化：（a）Q Sepharose Fast Flow(简称QFF)离子交换层析纯化取20 ml病毒浓缩液以2ml/min 的流速加入预先用10mM、pH 7.60之PBS平衡好的装有QFF填料的层析柱中，继续用10mM、pH 7.60之PBS以2ml/min的流速过柱，直至在QFF离子交换层析图谱OD280nm处无吸收峰出现后开始洗脱，洗脱采用1mol /L NaCl洗脱大于5倍柱体积时间，收集洗脱时OD280nm处吸收峰的样品，其中，洗脱峰1为主要病毒抗原峰，收集后‑80℃保存备用；（b）纯化洗脱峰的透析脱盐将步骤（a）的洗脱峰样品装入预先处理好的透析袋中，之后将透析袋置于装有10mM、pH7.20之PBS的玻璃容器内，磁力搅拌器搅拌，透析袋旋转速度为60～80次/min, 4℃透析24h，每8h更换一次玻璃容器内的缓冲液，经透析后的样品为澄清溶液，pH 7.0～7.40；（3）除菌过滤和灭活：用0.22 μm 滤器过滤纯化的病毒液，过滤后的病毒液按1:4000的比例加入福尔马林，先置于56℃灭活半小时，之后置于37℃灭活72小时，双抗体夹心ELISA检测灭活后的纯化轮状病毒抗原含量和免疫原性，灭活后抗原量应不低于20480EU/ml。