[发明专利]离子交换层析纯化制备人轮状病毒灭活疫苗的方法

权利要求书

1.离子交换层析纯化制备人轮状病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：

（1）病毒液的制备和浓缩：

在Vero 细胞上进行病毒扩增，规模化培养45个转瓶，细胞为致密单层时种毒，细胞密度为：1.33×10⁵个细胞/cm²×850cm²/转瓶 =1.1×10⁸个细胞/转瓶；当病毒增殖72h时收获病毒，经反复冻融3次后，8000rpm离心20min 取上清液收获得到9.8L含有病毒颗粒的病毒原液，病毒原液蛋白含量介于600ug/mL～700ug/mL,病毒感染性滴度为4.0lgCCID50 /mL以上；用截留分子量为100KDa的切向流超滤系统将9.8L病毒原液超滤浓缩36倍至0.27L,以备进入步骤（2）；

（2）病毒的纯化：

（a）Q Sepharose Fast Flow(简称QFF)离子交换层析纯化

取20 ml病毒浓缩液以2ml/min 的流速加入预先用10mM、pH 7.60之PBS平衡好的装有QFF填料的层析柱中，继续用10mM、pH 7.60之PBS以2ml/min的流速过柱，直至在QFF离子交换层析图谱OD280nm处无吸收峰出现后开始洗脱，洗脱采用1mol /L NaCl洗脱大于5倍柱体积时间，收集洗脱时OD280nm处吸收峰的样品，其中，洗脱峰1为主要病毒抗原峰，收集后-80℃保存备用；

（b）纯化洗脱峰的透析脱盐

将步骤（a）的洗脱峰样品装入预先处理好的透析袋中，之后将透析袋置于装有10mM、pH7.20之PBS的玻璃容器内，磁力搅拌器搅拌，透析袋旋转速度为60～80次/min, 4℃透析24h，每8h更换一次玻璃容器内的缓冲液，经透析后的样品为澄清溶液，pH 7.0～7.40；

（3）除菌过滤和灭活：

用0.22 μm 滤器过滤纯化的病毒液，过滤后的病毒液按1:4000的比例加入福尔马林，先置于56℃灭活半小时，之后置于37℃灭活72小时，双抗体夹心ELISA检测灭活后的纯化轮状病毒抗原含量和免疫原性，灭活后抗原量应不低于20480EU/ml。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是检测纯化前后感染性滴度、抗原量及总蛋白去除率，包括： 

用荧光灶法测定病毒纯化前后感染性滴度和抗原量如表1：

表1纯化前后病毒样品的感染性滴度和抗原量检测结果

表1纯化前后病毒样品的感染性滴度和抗原量检测结果（续前）

用Lowry法检测病毒纯化前后样品蛋白含量及纯化后病毒收获液总蛋白去除率如表2：

表 2 经过Q FF 离子交换层析纯化后病毒收获液的总蛋白去除率

。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是检测纯化过程中病毒液的SDS-PAGE和 Western-blot：SDS-PAGE结果显示，与超滤浓缩液相比，QFF纯化目的峰样品蛋白条带数明显减少，未见明显杂蛋白条带；相对应的Western-blot 结果显示，蛋白条带为轮状病毒特异性蛋白条带。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是检测病毒在纯化过程中的基因组带型电泳，结果显示：病毒在纯化过程中，基因组带型未发生变异，带型稳定。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征是检测病毒在纯化过程中的基因组带型电泳，结果显示：病毒在纯化过程中，基因组带型未发生变异，带型稳定。