[发明专利]耐热菌的鼠源多克隆抗体的制备方法

摘要

一种耐热菌的鼠源多克隆抗体的制备方法，将耐热菌标准菌株通过培养基培养，制成1.4×108～4×109CFU/mL的耐热菌菌悬液，然后将耐热菌菌悬液与免疫佐剂按等体积混合，超声振荡至充分乳化，通过背部肌肉多点注射免疫雄性SD大鼠，免疫63～91天摘除眼球采血，制成耐热菌的鼠源多克隆抗血清，再采用饱和硫酸铵沉淀法和G蛋白亲和层析对耐热菌的鼠源多克隆抗血清分别进行分离、纯化，制备成耐热菌的鼠源多克隆抗体。本发明方法简单，成本低，所制备的耐热菌的鼠源多克隆抗体效价可达到12800，特异性良好，与常见食源性微生物无交叉反应，经电泳鉴定有较高纯度，可用于建立耐热菌免疫化学检测方法。

主权项

耐热菌的鼠源多克隆抗体的制备方法，其特征在于它由下述步骤组成：(1)制备耐热菌菌悬液将耐热菌标准菌株转接至250mL的402培养基，置于45℃气浴中振荡培养8小时，转接至凯氏培养基，41℃培养24小时，用无菌生理盐水冲洗凯氏培养基上培养的耐热菌，将冲洗下的耐热菌移至无菌三角锥瓶中充分混匀，离心分离，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤，向沉淀中加入无菌生理盐水，稀释成浓度为1.4×108～4×109CFU/mL的耐热菌菌悬液；(2)耐热菌免疫SD大鼠将步骤(1)中制备的耐热菌菌悬液与免疫佐剂按等体积混合，超声振荡至充分乳化，通过背部肌肉多点注射免疫雄性SD大鼠，注射体积为0.5～1.5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐剂，然后用弗氏不完全佐剂进行追加免疫，每次免疫的时间间隔为两周，免疫63～91天摘除眼球采血，制备成耐热菌的鼠源多克隆抗血清；(3)饱和硫酸铵沉淀法分离抗体向步骤(2)制备的耐热菌的鼠源多克隆抗血清中加入无菌生理盐水，逐滴加入pH值为8.0的饱和硫酸铵水溶液，耐热菌的鼠源多克隆抗血清与无菌生理盐水、饱、和硫酸铵水溶液的体积比为1∶1∶2，充分摇匀，4℃静置12小时，离心分离，弃去上清液，所得沉淀用生理盐水溶解，装入透析袋中透析；(4)G蛋白亲和层析纯化抗体向透析后的耐热菌的鼠源多克隆抗体中加入0.1mol/L pH值为9.0的Tris‑HCl缓冲液，调节耐热菌的鼠源多克隆抗体的pH值至8.0，用G蛋白亲和层析柱分离，上样量与柱体积之比为2∶1，流速为1mL/分钟，上样完成后用0.1mol/L pH值为8.0的磷酸盐缓冲液洗脱至基线稳定，用0.1mol/L pH值为3.0的柠檬酸缓冲液洗脱结合的耐热菌的鼠源多克隆抗体，收集耐热菌的鼠源多克隆抗体，装入透析袋中透析，用平均分子量为6000的聚乙二醇浓缩至与上样量体积相同。