[发明专利]一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法。本发明的制备方法，步骤为：以杂交瘤细胞总mRNA为模板反转录得cDNA，选用简并性低的通用引物扩增全套抗体重链可变区和轻链可变区基因；将扩增出的重、轻链可变区基因序列输入IMGT数据库进行分析，排除来源瘤细胞的抗体基因和无义基因，得到候选重链和轻链可变区基因；将该基因翻译成氨基酸序列后进行三维结构同源模建，获得单链抗体的三维模拟结构，与相应抗原靶标分子进行分子对接分析；分析结果正确的候选重链和轻链通过重叠延伸PCR法拼接成单链抗体基因，进行表达及抗体活性鉴定。本发明的制备方法适合所有源于单克隆杂交瘤细胞的单链抗体制备，过程简易、快速，产品质量高。

主权项

一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法，其特征在于步骤如下：（1）以杂交瘤细胞总mRNA为模板，Oligo dT为引物，反转录合成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板，在通用引物中筛选适当引物组，扩增全套抗体重链可变区和轻链可变区基因；所述杂交瘤为能够分泌抗目标抗原的单克隆抗体的杂交瘤；（2）步骤（1）得到的序列选择大小在300~500bp范围内，条带清晰单一的进行测序，序列输入IMGT数据库进行分析，排除来源于构成杂交瘤的融合伴侣瘤自身的抗体基因和无义基因，得到候选重链和轻链可变区基因；（3）将候选重链和轻链可变区基因翻译成氨基酸序列后进行三维结构同源模建，获得单链抗体的三维模拟结构，将该三维模拟结构与相应目标抗原分子进行分子对接分析，选出分析结果正确的候选重链和轻链可变区基因；（4）将分子对接分析结果正确的候选重链和轻链可变区基因通过重叠延伸PCR法拼接成单链抗体基因，进行表达及抗体活性鉴定，最终得到目的单链抗体。