[发明专利]卵巢癌细胞中双微体的脉冲场凝胶电泳分离纯化方法

摘要

本发明提供了一种卵巢癌细胞中双微体的脉冲场凝胶电泳分离纯化方法。本发明将制备好的含卵巢癌细胞全基因组DNA的胶块置于0.5％琼脂糖凝胶的点样孔中，用相同浓度的琼脂糖封闭加样孔；在10℃的0.5×TBE电泳缓冲液中适宜电泳条件下先进行第一向FIGE模式电泳，随后调整方向进行第二向CHEF模式电泳，分离大片段DNA分子。之后将目的片段回收，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测回收所得DNA片段大小。本发明的方法通过双向电泳的方式对脉冲场凝胶电泳的优化可实现对双微体简便、高效的分离，且DMs的纯度高并为后续DMs相关实验的开展奠定了坚实的基础。

主权项

一种卵巢癌细胞中双微体的脉冲场凝胶电泳分离纯化方法，其特征在于，步骤如下：(1)样品制备人卵巢癌细胞UACC‑1598在含10％FBS的RPMI‑1640培养基中，于5％CO2、37℃条件下进行培养；收集对数生长期、汇合率为70％～80％的人卵巢癌细胞UACC‑1598，计数后重悬于PBS，使细胞密度为1～2×108细胞/mL，并在37℃水浴中孵育；加入等体积37℃的1.4％低熔点琼脂糖，迅速混匀后倒入洁净模具中，4℃放置10～15min使其凝固；将胶块从模具中取出后置于3～5倍体积的细胞裂解液中于37℃水浴中震荡孵育90min至胶块透明；弃细胞裂解液并用洗液反复洗胶块3次后置于3～5倍体积的蛋白酶K溶液，37℃水浴中震荡孵育6～12小时；洗涤三次后，置于贮存液中4℃保存；(2)脉冲场凝胶电泳将制备好的胶块置于0.5％琼脂糖凝胶的点样孔中，用相同浓度的琼脂糖封闭加样孔；在10℃的0.5×TBE电泳缓冲液中适宜电泳条件下先进行第一向FIGE模式电泳，电泳条件为：正向电压梯度：3～5V/cm，起始转换时间：50～70seconds，终止转换时间：220～260seconds；负向电压梯度：2～4V/cm，负向起始转换时间：15～30seconds，负向终止转换时间：50～70seconds；总电泳时间：36～45hours，随后调整方向进行第二向CHEF模式电泳，分离大片段DNA分子；电泳条件为：电压梯度：3～6V/cm；脉冲角度：120，起始转换时间：100～130seconds；终止转换时间：270～320seconds；电泳时间：25～30hours，以商品化的H.wingi和S.cerevisiae染色体为分子量标尺；(3)琼脂糖酶法回收DMs DNA对电泳凝胶中的垂直DNA条带进行切胶回收，切取含有目的DNA片段的低熔点琼脂糖凝胶，切成细块并称重，加入1/10体积的10×琼脂糖酶缓冲液用于平衡反应体系；于70℃10min熔化低熔点琼脂糖凝胶后，冷却至60℃并静置5min，加入琼脂糖酶于60℃消 化1小时，冰上放置15min后12000r/min离心15min，取上清液并加入1/10体积3mol/L乙酸钠溶液和1倍体积的异丙醇，混匀后‑20℃冷却6～12小时，之后，12000r/min离心15min，弃上清用70％的冷异丙醇清洗沉淀两次，干燥后加入TE溶解DNA沉淀，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测回收所得DNA片段大小。