[发明专利]一种适用于基因检测的WideSpace高通量扩增方法

摘要

本发明共公开了一种适用于基因检测的WideSpace高通量扩增方法，该方法包括了靶基因引物、通用放大引物和嵌套引物的设计，设计好通用放大引物后，将通用放大引物的上游分别添加到每条靶基因的上游引物5′端，将通用放大引物的下游分别添加到每条靶基因的下游引物5′端，即可得到嵌套引物。本发明克服了常规基因检测方法难以在一个反应中同步完成5个以上基因靶标的检测。本发明可以引用于转基因检测、病原微生物的检测筛查、多基因表达分析等相关领域。

主权项

一种适用于基因检测的WideSpace高通量扩增方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）设定靶基因和靶基因的数量n；（2）靶基因引物、通用放大引物、嵌套引物的设计：a）按照引物设计的一般原理进行靶基因引物的设计；b）将所有靶基因引物按照上游和下游顺次整合为一长链DNA；c）利用FastPCR或同类软件随机生成一段随机DNA片段，针对这段随机DNA片段进行引物设计，得到通用放大引物；将通用放大引物与步骤b）中的长链DNA进行二聚体分析，若二聚体均满足自由能的绝对值在7以内，否则返回步骤c）重新设计，同时将通用放大引物和靶基因进行NCBI Primer Blast在线分析，若通用放大引物和靶基因无非特异扩增，则完成通用放大引物的设计，否则返回步骤c）重新设计；d）将通用放大引物的上游分别添加到每条靶基因引物的上游5′端，将通用放大引物的下游分别添加到每条靶基因引物的下游5′端，即得到n对嵌套引物；（3）检测体系和反应条件：同时在一个检测体系中添加所有的嵌套引物和通用放大引物，引物间的比例为：嵌套引物1上游：嵌套引物1下游：嵌套引物2上游：嵌套引物2下游：嵌套引物3上游：嵌套引物3下游…：嵌套引物n上游：嵌套引物n下游：通用放大引物上游：通用放大引物下游等于1:1:1:1:1:1…:1:1:4:4；检测反应：20~25uL检测反应液含有1x 反应缓冲液, 2.0~5.0mmol/L MgCl2, 200~400μmol/LdNTP, 1.5~3U 耐热DNA 聚合酶,各种嵌套引物上游和嵌套引物下游浓度均为0.1~0.5μmol/L，通用放大引物上游和通用放大引物下游的浓度均为0.4~2μmol/L，1.5~5% DMSO，0.1~0.5 mol/L甜菜碱, 50~200 ng cDNA;反应条件为：预变性95℃，5 min；5~10个循环的预扩增：94℃，30 s；45℃～55℃, 35s; 72℃, 60 s ~120s; 35~40个循环：94℃，40s，55℃~62℃,40s，65℃~72℃，2 min ~5 min；补充延伸：72℃，10 min；(4)产物的检测：根据步骤（1）中靶基因的长度跨度，选择电泳系统进行检测。