[发明专利]活性污泥中氨氧化菌实时荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明涉及活性污泥中氨氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，属于污水生物处理技术领域，用于对污水处理厂活性污泥中的氨氧化菌的定量检测。目前，研究者多是采用等梯度稀释含有目标DNA片段的质粒制备标准品，进而建立定量标准曲线，但操作较为繁琐且成本较高。本发明采用基因组PCR扩增片段切胶纯化回收产物法建立检测氨氧化菌的实时荧光定量PCR标准曲线，初始模板数的对数与荧光域值的循环数Ct值之间呈现较好的线性关系，相关系数为0.999。利用建立的标准曲线对活性污泥中氨氧化菌进行定量检测。本发明为污水生物脱氮系统中主要功能微生物氨氧化菌的定量检测提供了一种经济、简便、可靠的分析方法。

主权项

1.一种活性污泥中氨氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：提取富集程度在80％以上的氨氧化菌的基因组DNA，经第一次常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后，将含有碱基对的凝胶条带切下并提取其中的DNA扩增片段；提取的DNA片段再进行第二次常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，将第二次琼脂糖凝胶电泳中含碱基对的凝胶条带切下，提取其中的DNA扩增片段作为实时荧光定量PCR检测氨氧化菌数量的标准品，在实时荧光定量PCR仪上进行检测，建立标准曲线；并利用建立的标准曲线对活性污泥中氨氧化菌进行定量检测；上述两次常规PCR扩增体系及反应条件如下：上述常规PCR扩增条件如下：94℃下预处理3min；30个循环反应，每个循环包括95℃ 45s、58℃ 30s、72℃ 45s；最后72℃4min；上述琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖质量百分比浓度为3％，电泳电压为75V，电泳时间为90min；上述实时荧光定量PCR扩增反应体系及反应条件为：扩增条件为95℃ 30s；40个循环反应，每个循环包括95℃5s，60℃20s；上述正向引物CTO189fA/B和CTO189fC按摩尔比2∶1混合。