[发明专利]海洋异养脱氮细菌的混养富集筛选方法

摘要

本发明公开了一种混养富集海洋异养脱氮细菌的方法。本发明通过前期自养方式后期异养的方式富集海洋脱氮细菌，保证具有异养硝化能力、异养硝化好氧反硝化能力的细菌繁殖，首先通过选择性培养基分离，其次检测分离菌株的氨单加氧酶基因和亚硝酸盐氧还酶基因，最后在异养培养基中通过氮平衡试验确定具有目的基因的菌株是否表达。通过自养和异养的交替驯化富集，分离获得并最终确定筛选菌株为异养硝化菌株或异养硝化好氧反硝化菌株。混养富集异养硝化好氧反硝化细菌不单单是细菌富集理论的突破，其菌株经过生物强化方法的固定对海洋循环养殖废水的生物脱氮具有较大的实际应用意义，适用于工厂化高密度养殖的硝化单元的废水处理中。

主权项

海洋异养脱氮细菌的混养筛选方法，其特征在于其按如下步骤进行：(一)、海洋异养脱氮细菌的自养富集驯化阶段：海洋异养脱氮细菌的自养富集驯化在一定体积的容器内进行，向容器内加入一定体积海洋养殖废水，控制水体的溶解氧在3mg/L以上，用Na2CO3溶液调节pH在7.5‑8.5之间，调节盐度在2.5％‑3.5％，控制水体温度在28±1℃，每天流加无机氨氮，使富集驯化液的氨氮浓度在0.2‑20mg/L。经过30‑50天的富集驯化，氨氮的添加浓度达到8‑20mg/L左右，自养富集驯化阶段结束。(二)、海洋异养脱氮细菌的异养富集驯化阶段：海洋异养脱氮细菌的异养富集驯化在一定的体积的容器内自养富集驯化结束后进行，控制水体的溶解氧在3mg/L以上，用Na2CO3溶液调节pH在7.5‑8.5之间，调节盐度在2.5％‑3.5％，控制水体温度在28±1℃，每天继续流加无机氨氮，使富集驯化液的氨氮浓度保持在8‑20mg/L，每天添加一定量鱼饵的浸出液，使异养阶段的CODMn在10‑400mg/L。异养养富集驯化持续5‑20天结束。(三)、海洋异养细菌的分离：海洋异养细菌的分离采用海水配制的固体有机培养基，将混养富集驯化液经系列稀释涂布于固体有机培养基上，23‑30℃培养2‑5天，对培养基上生长的菌落特征不同的菌落进行划线纯化后获得纯菌株转斜面保存。(四)海洋异养脱氮细菌的基因检测：利用特异性引物对氨单加氧酶(AMO)基因(amoA)和周质硝酸盐还原酶(NAR)亚基基因(napA)进行DNA扩增，电泳分离扩增产物，快速筛选具有潜在氨氧化能力和能进行硝酸盐还原的菌株。(五)海洋异养脱氮菌株的氮平衡分析：在自养型培养基中接种具有amoA或napA基因的菌株，在28±1℃，150‑200rmp转速下培养细菌24‑48小时，检测培养前后的氨氮、亚硝态氮、硝态氮和有机氮，经过氮素的定量计算，和不加菌的对照相比，确定异养脱氮菌株的氮代谢特性，获得异养硝化细菌或异养硝化好氧反硝化菌株。