[发明专利]一种中华鳖虹彩病毒的超分支滚环扩增检测方法

摘要

本发明公开了一种中华鳖虹彩病毒的超分支滚环扩增检测方法，特点是包括以下步骤：(1)设计1条锁式探针和1对针对锁式探针连接序列的通用引物；(2)配制锁式探针连接反应体系，进行连接反应；(3)配制HRCA反应体系，进行HRCA扩增反应，最后对HRCA反应产物进行检测，优点是具有比现有技术的PCR检测中华鳖虹彩病毒的方法具有更高的灵敏度、特异性和便捷性，并且简单易操作，检测方法快速高效，比常规PCR检测节省2-4h。

主权项

一种中华鳖虹彩病毒的超分支滚环扩增检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)锁式探针的合成：从基因库中选取一段中华鳖虹彩病毒独有的主衣壳蛋白MCP基因序列，从MCP基因序列中分别选取20个碱基作为锁式探针5′端和3′端的特异识别区，5′末端碱基和3′末端碱基在MCP基因序列上连续，从质粒载体pNAK1中选取一段序列，将该序列中与5′末端碱基和3′末端碱基互补的碱基替换后形成的核苷酸序列作为锁式探针的连接段部分，然后进行锁式探针的合成，所述的锁式探针的核苷酸序列如下：5’‑CTGCGTCACTCCCGTCGTGGtggactgctgaatccgttagccagcagccgcctccttattatcacttattcaggcgtagcaccagTCCGTCGGCTCCAATTACAC‑3’；105(2)根据锁式探针的连接段序列设计一对通用引物CF1和CF2，序列如下：CF1：5’‑CTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGA‑3’，24CF2：5’‑GCTGAATCCGTTAGCCAGCAG‑3’；21(5)锁式探针的连接反应：连接反应体系的终浓度分别为：锁式探针分别为100pM‑10μM，10×T4 DNA Ligase Buffer 1μl，样品模板DNA 2μl，加双蒸水至反应总体积10μl，连接的条件为：在94℃下变性5min后，再加1U/μl T4 DNA Ligase，在16℃的条件下，反应10‑60min；(4)HRCA反应体系扩增HRCA反应体系的终浓度分别为：dNTPs 0.4mM，CF1 0.4μM，CF2 0.4μM，pH 8.8de Tris‑HCl 20mM，KCl 10mM，MgS04 6.5mM，(NH4)2S04 10mM，0.1％Triton x‑100，8U Bst DNA聚合酶大片段和连接反应产物2μL，加双蒸水至反应体系总体积为25μL，将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为61‑65℃，扩增反应时间为10‑60min；(5)HRCA反应产物的检测将HRCA扩增反应产物通过琼脂糖凝胶电泳观察扩增条带，如果条带呈阶梯状分布则表示该样品的STIV的检测结果为阳性，反之无扩增条带或扩增条带为非阶梯状分布，则为阴性。