[发明专利]一种快速鉴定结核分枝杆菌死活的方法

摘要

本发明公开了一种快速鉴定结核分枝杆菌死活的方法，其原理是将叠氮溴化乙锭与环介导恒温核酸扩增技术相结合，根据结核分枝杆菌保守基因IS6100序列设计四条特异性引物，采用四条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63~65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到109~1010个拷贝，通过加入SYBRGreenI观察颜色变化来判断扩增与否。本发明方法检测时间短、特异性强、灵敏度高，对结核分枝杆菌死活菌的鉴定准确率达99%以上，可广泛应用于临床和疾控部门的检测鉴定。

主权项

一种快速鉴定结核分枝杆菌死活的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）样品的预处理：取待检样品，加入终浓度为10至1000μg/mL的叠氮溴化乙锭(ethidium bromide monoazide，EMA)，暗处放置1~100min；然后暴露在500~1000W的卤素灯下照射10秒~10分钟，此过程在冰浴上进行；所述待检样品为已鉴定含有结核分枝杆菌的样品或分离的结核分枝杆菌；（2）模板DNA的制备：取上述处理过的样品，提取DNA作为模板DNA；（3）恒温基因扩增反应：反应体系为25µl，包括4条特异性引物，1~10mM的dNTPs，1~10mM的MgSO4，1~10M的甜菜碱，1~5µl 模板DNA，1~8U Bst DNA聚合酶，加蒸馏水至25µl，混匀；于60～65℃下，扩增60～80分钟；（4）结果判断：在上述反应产物中加入1~2μl显色剂SYBR GREENⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若颜色呈绿色则说明样本中存在活的结核分枝杆菌，若颜色呈橙色，则说明样本中不存在活的结核分枝杆菌；步骤（3）所述特异性引物选自以下5组引物中任一组，其中外引物1的浓度为0.1~10mM，外引物2的浓度为0.1~10mM，内引物1的浓度为1~10mM，内引物2的浓度为1~10mM：引物组1：外引物1：TCATCGCCGATCATCAGG（SEQ ID No.1）外引物2：CGAGTTTGGTCATCAGCCG（SEQ ID No.2）内引物1：TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT（SEQ ID No.3）内引物2：TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG（SEQ ID No.4）；引物组2：外引物1：ACTACGACCACATCAACCG（SEQ ID No.5）外引物2：TCAGCGATCGTGGTCCT（SEQ ID No.6）内引物1：CGGGCACCGTAAACACCGTACGATGGCGAACTCAAGGAG（SEQ ID No.7）内引物2：AGTGTGGCTAACCCTGAACCGAGTTTGGTCATCAGCCGTTC（SEQ ID No.8）；引物组3外引物1：ACGATGGCCACCTCCA（SEQ ID No.9）外引物2：CGGGTTTGATCAGCTCGG（SEQ ID No.10）内引物1：CTCGCTGAACCGGATCGATGTGGAAGGCGTACTCGACCTGA（SEQ ID No.11）内引物2：CAGGCATCCAACCGTCGGTTCGTCTCGGCTAGTGCA（SEQ ID No.12）；引物组4外引物1：ATCGATCCGGTTCAGCG（SEQ ID No.13）外引物2：AGTAGGCAGCCTCGAGTTC（SEQ ID No.14）内引物1：AGGGCTTGCCGGGTTTGATCAATGCACTAGCCGAGACGA（SEQ ID No.15）内引物2：AGGATGTCGAGTTGGCCACCTCGCCGCAGTACTGGTA（SEQ ID No.16）；引物组5外引物1：GAGTCGATCTGCACACAGC（SEQ ID No.17）外引物2：GAGTTTGGTCATCAGCCGT（SEQ ID No.18）内引物1：TGAGTTCGCCATCGCGCATGCCGATCGCCCCAT（SEQ ID No.19）内引物2：GTCCACGCCGCCAACTACGCTCGATGCCCTCACGGT（SEQ ID No.20）。