[发明专利]胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表达载体的构建、筛选及其用途

摘要

本发明涉及胃癌靶向STAT3基因的siRNA表达载体的构建、筛选及其用途。本发明利用RNA干扰技术为主，针对STAT3基因的不同靶序列，构建了两个能在哺乳动物细胞中表达siRNA的表达质粒STAT3-siRNA1/2。本发明胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表达载体能高效的特异性的抑制STAT3基因表达，可用于制备治疗高表达STAT3基因的胃癌的基因药物。

主权项

靶向STAT3基因的siRNAs表达载体，其特征是，以pGPU6/GFP/Neo siRNA ExpressionVector为载体，针对信号转导子和转录激活子3(STAT3)编码区上、中游的两段序列，在较高表达STAT3的胃癌细胞系HGC 27中发挥RNA干扰作用；这两段STAT3特异性RNA干涉靶序列分别为：①5’ GCAACAGATTGCCTGCATTGG 3’，起始于956位；②5’ GCGTCCAGTTCACTACTAAAG 3’，起始于1243位，是用于STAT3基因相关性胃癌的治疗性物质，由以下方法制得：(1)RNA干涉靶序列的选择及插入序列的设计与合成选择STAT3基因编码区的两段序列①5’ GCAACAGATTGCCTGCATTGG 3’②5’ GCGTCCAGTTCACTACTAAAG 3’，设计并分别体外合成两对互补的寡核苷酸序列，序列如下：①STAT3寡核苷酸序列1：正义链：5’ CACCGCAACAGATTGCCTGCATTGGTTCAAGAGACCAATGCAGGCAATCTGTTGCTTTTTTG 3’反义链：5’ GATCCAAAAAAGCAACAGATTGCCTGCATTGGTCTCTTGAACCAATGCAGGCAATCTGTTGC 3’②STAT3寡核苷酸序列2：正义链：5’ CACCGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTTCAAGAGACTTTAGTAGTGAACTGGACGCTTTTTTG 3’反义链：5’ GATCCAAAAAAGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTCTCTTGAACTTTAGTAGTGAACTGGACGC 3’(2)合成的寡核苷酸分别与线性载体pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector连接、转化、扩增及质粒的提取将步骤(1)合成的两对寡核苷酸等量混匀，95℃作用3分钟后缓慢冷却至室温，然后将结合的双链寡核苷酸与线性化的pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector质粒载体连接，最后转化到JM109大肠杆菌，经卡那霉素筛选，挑选单个菌落大量培养；用质粒提取试剂盒提取纯化质粒DNA；(3)质粒的鉴定将步骤(2)提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定合成的寡核苷酸是否已正确转入pGPU6/GFP/Neo siRNAExpression Vector质粒中。