[发明专利]一种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶的制备法

摘要

本发明涉及生物医药的基因重组领域，具体地说是一种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶的制备法；其特征在于包括以下步骤：采用PCR技术从沃氏菌的基因组DNA中扩增出天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA，将上述DNA用DNA连接酶连接到克隆质粒中，从克隆质粒中切割出天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA，再连接到原核细胞表达质粒中，表达质粒转染到大肠杆菌中，在抗生素选择培养基中培养此转染的细菌以扩增含有天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA的表达质粒，收集转染的菌体，离心分离出菌体；破碎细菌，释放重组天门冬酰胺酶；用二步柱层析法分离精制重组沃氏菌天门冬酰胺酶；本发明具有工艺步骤少，可控制质量且大量制备的优点。

主权项

一种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶的制备法，其特征在于包括以下步骤：a、采用PCR技术从沃氏菌的基因组DNA中扩增出天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA，该DNA片段的5′和3′端各带有至少一个特定的限制性内切酶点；b、将上述天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA用DNA连接酶连接到克隆质粒中；c、利用特定的限制性内切酶从克隆质粒中切割出天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA，再连接到已用同样的限制性内切酶消化后的原核细胞表达质粒中；d、将上述的含有天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA的表达质粒转染到大肠杆菌中，在抗生素选择培养基中培养此转染的细菌以扩增含有天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA的表达质粒，在培养基中加入诱导物诱导重组天门冬酰胺酶的合成；e、收集转染的菌体，离心分离出菌体；破碎细菌，释放重组天门冬酰胺酶；f、用二步柱层析法分离精制重组沃氏菌天门冬酰胺酶；g、用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测鉴定重组沃氏菌天门冬酰胺酶，用考马斯亮蓝染色后可见一个35kDa的蛋白质条带与计算值一致。