[发明专利]含有番茄LeEXP2基因的重组载体及重组菌及LeEXP2基因在重组菌中的表达

摘要

本发明公开了含有番茄LeEXP2基因的重组载体及重组菌及LeEXP2基因在重组菌中的表达，本发明首先从番茄中克隆了LeEXP2基因；进一步将LeEXP2基因构建至巴斯德毕赤酵母表达载体；通过电转化获得一种含有番茄LeEXP2基因的重组巴斯德毕赤酵母菌；诱导番茄LeEXP2基因在重组巴斯德毕赤酵母菌中的表达；本发明的重组菌能有效地表达目的蛋白LeEXP2。克服了现有技术从植物中纯化出膨胀素的量有限，无法大量应用到纤维素降解中，自然界中有诸多的废弃的木质纤维素，本发明获得的LeEXP2蛋白能提高纤维素酶降解纤维素的效率，对清洁有效的利用废弃的纤维素生产能源，解决当前能源危机具有极其重要意义。

主权项

一种含有番茄LeEXP2基因的重组载体，其特征是用下述方法构建：(1)提取番茄的总RNA，反转录成cDNA，以该cDNA为模板，用序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为上、下游引物进行PCR，扩增出序列表中SEQ ID NO.3所示的744bp的LeEXP2基因，连接至TA载体pGEM‑T，获得含有番茄LeEXP2基因的质粒pGEM‑LeEXP2；(2)LeEXP2基因构建至巴斯德毕赤酵母表达载体：以所述质粒pGEM‑LeEXP2为模板，以序列表中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列为上、下游引物进行PCR扩增，获得序列表中SEQ ID NO.6所示的703bp片段，将所述703bp片段经TA克隆连至pGEM‑T载体，命名为pTLeEXP2；提取质粒pTLeEXP2和巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZalpha A质粒，用EcoRI和XbaI同时酶切pTLeEXP2和pPICZalpha A，经琼脂糖凝胶电泳后回收酶切pTLeEXP2得到SEQ ID NO.7所示的689bp片段和酶切pPICZalpha A得到的SEQ ID NO.8所示的3530bp片段；回收产物连接后转化到大肠杆菌TOP10F′的感受态细胞中，涂含Zeocin 25μg/mL的LB平板，培养12‑16h，得到含pPICZalpha A‑LeEXP2质粒的大肠杆菌，提取大肠杆菌中pPICZalpha A‑LeEXP2质粒，即得到含有番茄LeEXP2基因的重组载体。