[发明专利]一种猪成熟脂肪细胞快速去分化为前体脂肪细胞的培养方法

摘要

本发明公开了一种猪成熟脂肪细胞快速去分化为前体脂肪细胞的培养方法，包括以下步骤：a.猪成熟脂肪细胞的分离；b.天花板培养法去分化猪成熟脂肪细胞；c.去分化脂肪细胞的传代培养。本发明提供的方法能够廉价、快速而高效的获得大量去分化的脂肪细胞，所使用的培养基价格低廉，去分化的代价较低，可以大范围的推广使用。

主权项

一种猪成熟脂肪细胞快速去分化为前体脂肪细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：a.猪成熟脂肪细胞的分离无菌条件下采集1‑30日龄仔猪颈、背部皮下脂肪组织，把剪下的脂肪组织放在玻璃皿中，用含有双抗的PBS缓冲液清洗2次。然后将脂肪组织转入到另一个干净的玻璃皿中，并用眼科手术剪将脂肪组织剪成约1mm3的小块，之后将脂肪组织碎块转入一个体积为30ml的小玻璃瓶中，向小玻璃瓶中加入10‑15ml 1％Ⅰ型胶原酶消化液，盖好盖子后将瓶口用封口膜封好后带出细胞间，在37℃水浴锅中振荡消化；消化时间到了后用酒精棉球将玻璃瓶擦拭干净并带入细胞间，在无菌操作台上加入等体积的DMEM/F12完全培养基，中和胶原酶的消化反应，然后将细胞消化液经两层200目不锈钢细胞筛网过滤到100mL烧杯中，过滤完后将滤液转入到10mL离心管中；在低速离心机中，以800‑900r/min离心3‑5min，小心取出10mL离心管，离心管中最上层可见的白色的细胞团即为成熟脂肪细胞；用枪将白色的细胞团小心吸至一新的10ml离心管，之后加入5ml左右的PBS并用枪反复吹打，以纯化成熟脂肪细胞，之后800r/min离心3‑5min；重复3次，直至得到的细胞悬液纯白色为止；b.天花板培养法去分化猪成熟脂肪细胞将分离的成熟脂肪细胞接种入25cm2的培养瓶中，然后在瓶内灌满含15％～25％胎牛血清的DMEM/F12生长培养基；盖紧瓶盖，轻轻摇匀，然后颠倒，静置于37℃，5％的CO2和95％的空气的培养箱中；培养至第七天时，倒掉培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞3次，然后正置培养瓶，加入6‑8ml含15％～25％胎牛血清的DMEM/F12生长培养基，之后每四天更换一次培养基，大约12天便可达到融合；c.去分化脂肪细胞的传代培养待细胞达到90％‑95％融合后，倒掉培养基，用PBS清洗两次，然后加入2ml温育过的含0.02％EDTA的0.25％的胰酶消化液，孵育片刻，显微镜下观察到95％‑99％的细胞均变圆，然后加入含15％～25％胎牛血清的DMEM/F12生长培养基1‑2ml终止消化，然后用弯头吸管吹打瓶底，将细胞全部吹落下来，之后1500r/min离心5min，弃掉上清，在离心管中加入含15％～25％胎牛血清的DMEM/F12生长培养基900μl，然后1∶3传代；大约2‑3天细胞长满后，便又可进行传代。