[发明专利]核酸扩增方法

摘要

本发明一般性地涉及扩增目的核酸区域的方法，更特别地，本发明涉及通过巢式单管PCR来扩增目的核酸区域的方法。设计本发明方法以提供下述手段，即通过靶向至少一个外引物的反义核酸分子来选择性失活所述外引物功能，从而在整个反应过程中保持扩增效率。在单管巢式PCR的背景下开发实现用外引物有效扩增而后用内引物有效扩增的手段可用于一系列应用，其包括但不限于诊断和/或监测特征为特定基因序列的疾病状况，以及表征或分析特定目的基因区域。本发明方法不仅用于简单的检测，还能进行定量。

主权项

一种扩增目的核酸区域的方法，所述方法包括：(i)将核酸样品与以下项相接触：(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm；和针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的Tm；和(c)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且其中(b)和(c)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的核酸样品，所述退火温度使所述第一引物杂交但不使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的核酸样品，所述退火温度使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交。