[发明专利]牛子宫内膜炎病原快速诊断方法

摘要

本发明涉及一种牛子宫内膜炎病原快速诊断方法，属于牛子宫内膜炎病原诊断方法。从子宫内膜炎患牛子宫黏液样品中抽提总DNA，然后对16S rDNA的可变区进行套式PCR扩增，通过DGGE进行分析，能检测到难以或不能培养的治病菌，更能精确反映子宫内膜炎发生时母牛子宫内致病菌的动态变化。可以找出其中的优势致病菌，从而确定主要致病菌。此方法可以深入了解患病牛子宫内致病微生物的组成及其量化关系，可分析确定微生物在子宫内膜炎发病过程中的作用，确定主要致病菌，有效地对牛子宫内膜炎的病原菌诊断。

主权项

一种牛子宫内膜炎病原快速诊断方法，其特征在于包括下列步骤：(一)病料的采集利用子宫内膜活检采样器进行子宫样品的采集，采集后将棉拭子放入含2ml灭菌生理盐水2ml的冻存管内以制成菌体稀释液，密封，充分摇匀，一部分放于加入冰袋的保温箱内用于分离培养，另一部分液冻存；(二)病料处理细菌裂解：病料用TE缓冲液悬浮后，加入抽提缓冲液，37℃哺育1h，再加入溶菌酶10mg/mL，37℃温育2h；细菌核酸抽提：采用常规酚/氯仿抽提，提取后对其进行琼脂糖凝胶电泳验证；(三)套式PCR设计并合成两对套式PCR引物Pmuu492 1、Pmuu492 2和pm442 1、pm442 2。在Pmuu492 1与pm442 1的5′端加上GC clmap结构；套式PCR 16s rDNA引物，序列(5′→3′)Pmuu492 1 ACTCCTACGGGAGGCAGCAGPmuu492 2 AACGCGAAGAACCTTACpm442 1 CCTACGGGAGGCAGCAGpm442 2 CCGTCAATTCATTTGAGTTTGCclmap CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG取子宫黏液菌体稀释的液1ml，利用菌体DNA提取试剂盒提取子宫粘液中的菌体总DNA；再以菌体总DNA为模板，利用Ex Taq酶和引物Pmuu492 1、Pmuu492 2，进行第一次PCR扩增；PCR条件为94℃预变性8min；94℃变性25s、58℃退火45s、72℃延伸45s，30个循环后；72℃恒温7min；再以扩增产物为模板，利用Ex Taq酶和引物pm442 1、pm442 2进行第二次PCR扩增，PCR条件为94℃预变性10min；94℃变性45s、54℃退火60s、72℃延伸60s，35个循环；72℃恒温10min；对于得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以验证扩增产物；(四)变性梯度凝胶电泳分析采用Bio RadoeodeTM Universal Mutation Detection System对套式PCR反应产物进行分离：(1)变性梯度胶的制备：使用梯度混合装置，制备8％的聚丙烯酞胺凝胶，变性剂浓度从30％到60％(100％的变性剂为7mol/L的尿素和40％的去离子甲酰胺的混合物)，其中变性剂的浓度从胶的上方向下方依次递增；(2)套式PCR样品的加样：待变性梯度胶完全凝固后，将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳槽中，取第二次PCR产物50微升加入上样孔。(3)电泳及染色：在160v的电压下，60℃电泳3h；电泳结束后，使用EB对凝胶进行染色0.5h；(4)胶图扫描：将染色后的凝胶用Bio Radoeode凝胶成像系统获取胶图；(5)图像分析对各条带进行标号，记录；对各条带内DNA比例关系并得到直观的曲线图并比较各条带之间的DNA含量；根据以上分析得到优势致病菌并确定回收目的带；(6)目条带回收对分析后选定的条带，使用page胶回收试剂盒进行回收纯化。(7)连接反应(a).取一支0.5ml微离心管，置于冰浴中，分别加入：10×连接Buffer 1ul；回收的PcR产物(1000ng/ul) 5ul；T载体(50ng/ul) 1ul；T4DNA连接酶 1ul；DDW 70ul：总体积 15.0ul(b).混匀，放在调好16℃的DNA连接仪内，然后置4℃冰箱冷藏放置10h；(8)转化(a)转化反应在灭菌的1.5ml离心管中加入50ul DH5α感受态菌及5ul的连接产物，混匀后冰浴30min；将离心管移入52℃水浴中，2min后(切忌振荡)。立即将离心管置于冰浴中5min；向离心管中加入200ul LB液体培养基，在：37℃恒温振荡器上以110r/min培养40min。以利于转化后的受体菌，在良好的环境：通气、新鲜的LB液体培养基中繁殖生长；(b)涂板取反应物在平板上涂布；涂布菌液的平板置室温下干燥，然后倒置在37℃温箱中培养12h。挑取单个阳性菌落，液体培养基扩人培养10h；(9)质粒提取(a).取1ml过夜培养的菌液加入1.5ml离心管中。于12000r/min×g离心30秒，去除上清；(b).加250ul Resuspension Buffer，重悬细菌沉淀。再加入250ul细胞Lysis Buffer，轻柔颠倒4 6次；(c).加350ul Neutralization Buffer，立即轻柔颠倒离心管4 6次。于12000g离心10分钟；(d).将步骤3离心后得到上清转移到Spin column内，于6000r/min×g离心1分钟，并弃去接液管中的液体；(e).向Spin cnlumn内加入650ul Wash Buffer，于12000g离心30 60秒，并弃去接液管中的液体。再重复一次此操作；(f).再次于12000r/min×g离心1min，然后将Spin column转移到无菌的1.5ml离心管中，向Spin column内加入50ul Elution Buffer，室温静置1min；(10)测序：将质粒送去生物公司测序，然后与基因bank中收录的相比对，确定治病菌种属，完成诊断。