[发明专利]一种罗丹明B酶联免疫检测方法

摘要

一种罗丹明B酶联免疫检测方法，属于酶联免疫检测(ELISA)技术领域。本发明公开了一种罗丹明B多克隆抗体酶联免疫检测方法，利用合成的罗丹明B免疫原免疫健康的新西兰大白兔得到多克隆抗体，以罗丹明B为标准品，以罗丹明B半抗原与OVA的偶联物作为包被原，建立了罗丹明B的间接ELISA方法，为罗丹明B的残留检测提供了快速高效的检测方法，由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好。检测限(IC90)为0.028ng/mL、半数抑制量(IC50)为1.3ng/mL和检测范围(IC20～IC80)为0.07～17.5ng/mL。免疫反应的高特异性和亲和性使ELISA检测罗丹明B具有极高的选择性和灵敏度。

主权项

一种罗丹明B酶联免疫检测方法，其特征在于利用合成的罗丹明B免疫原免疫健康白兔得到多克隆抗体，以罗丹明B为标准品，以罗丹明B半抗原与OVA的偶联物作为包被原，建立调味品中的罗丹明B的间接竞争酶联免疫检测方法；步骤如下：(1)以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释罗丹明B-OVA包被原，稀释质量比为1∶1000～1∶64000，稀释后加入酶标板中，每孔100μL；4℃孵育过夜，封闭、洗涤；(2)将系列浓度梯度的罗丹明B标准品加入酶标板中，每孔50μL；同时加入以抗体稀释液稀释为1∶1000～1∶4000的多克隆抗体，每孔50μL；37℃竞争0.5h后以含吐温的磷酸盐缓冲液PBST洗涤3～5次，加入以抗体稀释液稀释为1∶1000～1∶3000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP，每孔100μL，37℃作用0.5h后以PBST洗涤3～5次；所述PBST溶液：含0.05％Tween-20的0.01M PBS溶液；所述封闭液：含0.1％明胶的pH 9.6、0.05M碳酸盐缓冲溶液；所述抗体稀释液：含0.1％明胶的PBST溶液；(3)配置显色液A液：配方为每100mL超纯水中加入0.933g柠檬酸，3.68gNa2HPO4·12H2O，18μL30％H2O2；B液：配方为60mg四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇中；使用前将A液与B液以5∶1体积比混合；(4)加入显色液100μL，37℃显色15min；加入终止液2M硫酸溶液，酶标仪450nm测吸光值OD；根据不同浓度罗丹明B标准液的吸光值绘制罗丹明B浓度-吸光值标准曲线；(5)调味品的提取液作为样品溶液，直接加样于微孔中，进行ELISA测定，酶标仪450nm测吸光值OD，对照标准曲线测出调味品的罗丹明B浓度。