[发明专利]一种浓缩纯化肝素的生产工艺

摘要

本发明公开了一种浓缩纯化肝素的生产工艺，利用扩张柱床技术在粗品肝素的溶液中，将肝素与杂质蛋白、核酸及其余硫酸多糖分离，浓缩，纯化一次完成。改变传统的盐解-离子交换树脂法多步骤完成的工艺。采用扩张柱床离子交换树脂工艺分离浓缩纯化精品肝素，采用乙醇沉淀、丙酮脱水，肝素效价＞180IU/mg。采用扩张柱床离子交换树脂工艺减少工序，缩短时间，降低成本，提高效率和质量。

主权项

1.一种浓缩纯化肝素的生产工艺，其特点在于，采用扩张柱床离子交换树脂法可将猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜、肝、肺脏等脏器的组织匀浆的提取液不经过预处理直接采用色谱技术分离、浓缩、纯化肝素的生产技术，还可用于粗品肝素的精制，改变了使用传统的离子交换固定柱床吸附技术原料液中不能含有不溶性颗粒的限制。其原理在于吸附介质颗粒在向上流动的液体的作用下膨胀起来，吸附介质颗粒在床体中均匀的悬浮，并按照不同的颗粒尺寸和密度形成梯度而有续的排列，形成一个均衡、稳定的吸附环境，液体中的目标肝素被吸附于介质上，而细胞、细胞碎片、杂蛋白、核酸及杂多糖和其他的组织碎片将通过柱子而流出去，洗脱目标肝素时从相反方向将吸附介质压紧，再用洗脱缓冲液将目标肝素洗下来。扩张柱床色谱技术兼有流化床和填充床的优点，不需预先除去料液中的颗粒而可以直接从料液中吸附目标产物。从而起到有效的吸附分离作用。扩张柱床离子交换色谱技术不但可用于从哺乳动物脏器匀浆液直接提取肝素，还可用于粗品肝素的精制。采用扩张柱床离子交换色谱技术从哺乳动物脏器匀浆液直接提取肝素和用粗品肝素精制肝素，大大降低了肝素纯化工艺的复杂性，提高了产率，降低了生产成本。改变以往的国内树脂法精制肝素的生产中，基本上都是采用分批吸附的方法。分批吸附法理论塔板数低，柱效损失大，纯化效率低，对目的分子吸附不够充分，因此损失大。采用扩张柱床离子交换色谱技术提取肝素，可将肝素与杂质蛋白、核酸及其余硫酸多糖分离，浓缩，纯化一次完成。减少工序，缩短时间，降低成本，提高效率和质量。采用扩张柱床离子交换色谱技术直接从匀浆液中提取肝素，肝素单位效价达到120U/mg以上，用粗品精制肝素，效价达到160U/mg以上，产品中紫外区杂质(260nm，280nm)均满足药典要求；技术内容：(1)哺乳动物小肠粘膜的匀浆液经碱盐水解、胰蛋白酶酶解(猪牛羊等哺乳动物的肝脏肺脏的组织匀浆液加入0.1-0.5％木瓜蛋白酶)、高温变性和过滤处理，经过在一定离子浓度和PH条件下进行扩张柱床吸附层析法吸附、浓缩、纯化肝素，乙醇沉淀，丙酮脱水，低温干燥。(2)粗品肝素经碱盐水和胰蛋白酶处理、高温变性和过滤处理，后经过在一定离子浓度和PH条件下进行扩张柱床吸附层析法吸附、浓缩、纯化肝素，乙醇沉淀，丙酮脱水，低温干燥。工艺流程粗品制备：a)猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜或肝、肺等脏器的组织匀浆液50g左右加水至250L，加入NaCI至1％-8％，搅拌、静置、过滤。肠粘膜滤液加入0.1-0.5％胰蛋白酶(肝脏肺脏的组织匀浆液加入0.1-0.5％木瓜蛋白酶)。b)在pH7.5-10.5，35-45℃下酶解数小时，NaOH调pH至8.0-10.0，升温至50-55℃，保温2-4h，不断搅拌，然后快速升温到92-95℃，保持10-15min，趁热用80目滤网过滤，滤液(I)备用。c)扩张床柱Streamline50(5cm内径)、(购自AmershamPharmaciaBiotech(瑞典))装入已处理好的强碱性阴离子交换树脂。控制温度40-60℃，用蠕动泵将pH为7.5-10.5，适量MTris-HCl缓冲液自柱床底部泵入，使树脂扩张并保持平衡。保持pH值不变，将适量滤液(I)加MTris-HCl缓冲液配制成NaCI为2-6％，pH为7.5-10.5的溶液，用蠕动泵通进扩张交换柱中先平衡树脂，然后反复进行离子交换，流速约为每小时2倍柱床体积，直至流出液检验无肝素，全部吸附在树脂上为止。d)然后配制适量的的2-6％氯化钠溶液，MTris-HCl缓冲液调节pH3-5，以2～3个沉积床体积的缓冲液平衡/扩张柱床后，以5-6倍沉积床体积的缓冲液除杂，整个过程控制温度15-25℃，流速约为每小时2.5柱床体积。e)关掉蠕动泵，使D254树脂重新沉积，调节活塞至刚好在沉积床的表面，然后以向下的液流和沉积床的状态进行洗脱。树脂先用约4倍柱床体积的3-8％的氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液。再用约2倍柱床体积的2-7％氯化钠溶液(用量先多后少)同法洗脱2次。合并全部洗脱液，调节pH为6。f)按洗脱液体积加入1.0倍量的预冷乙醇，沉淀过夜。g)次日吸除乙醇。沉淀物用2％氯化钠溶液溶解，调pH至6.0。按溶液体积加0.7倍乙醇，沉淀过夜。h)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用无水乙醇、丙酮洗涤脱水。真空干燥后得肝素，效价为120U/mg以上。精品制备：a)将效价为60-100U/mg左右的肝素粗品以1∶10的比例溶于3％的氯化钠溶液中，然后再用2％的氢氧化钠溶液调pH至8-11，于室温静置数小时，真空抽滤，去沉淀物，滤液待用。b)在上述清液中加入0.01-0.1％胰蛋白酶，在pH7-10，35-45℃酶解数小时，升温98-100℃，10-15min，趁热真空抽滤，滤液备用。c)扩张床柱Streamline50(5cm内径)、(购自AmershamPharmaciaBiotech(瑞典))装入已处理好的强碱性阴离子交换树脂，用蠕动泵将pH7-10，适量MTris-HCl缓冲液自柱床底部泵入，使树脂扩张并保持平衡。d)控制温度40-60℃，将适量滤液加MTris-HCl缓冲液配制pH为7.5-10.5的溶液，用蠕动泵通进扩张交换柱中反复进行离子交换，交换过程中保持pH值与温度恒定，流速约为每小时2倍柱床体积，直至流出液检验无肝素，全部吸附在树脂上为止。e)然后配制适量的预冷的2-6％氯化钠溶液，MTris-HCl缓冲液调节pH1-3，以2～3个沉积床体积的缓冲液平衡/扩张柱床后，以5-6倍沉积床体积的缓冲液除杂，整个过程控制温度2-5℃，流速约为每小时2.5柱床体积。f)关掉蠕动泵，使树脂重新沉积，调节活塞至刚好在沉积床的表面，然后以向下的液流和沉积床的状态进行洗脱。树脂先用用约4倍柱床体积的2-6％氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液。再用约2倍柱床体积的2-6％氯化钠溶液(用量先多后少)同法洗脱2次。合并全部洗脱液，调节pH为6。g)按洗脱液体积加入1.0倍量的预冷乙醇，沉淀过夜。h)次日吸除乙醇。沉淀物用2％氯化钠溶液溶解，调pH至6.0。按溶液体积加0.7倍乙醇，沉淀过夜，i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用无水乙醇、丙酮洗涤脱水。真空干燥后得精品肝素，效价为150U/mg以上；如权利要求1所述：扩张柱床离子交换色谱技术的原料为猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜、肝、肺脏等脏器和粗品肝素；