[发明专利]一种鉴定单核苷酸多态性等位位点比例的方法

摘要

本发明公开了一种鉴定SNP等位位点形式和比例的方法，在PCR扩增SNP等位位点的2个碱基时，设计上下游引物中，一方面利用“分子开关”机制，在设计检测SNP引物时，采用硫修饰，结合高保真酶，可保证2种碱基扩增的特异性，为进一步检测奠定了基础；另一方面分别用不同的荧光基团对2种上游引物作了修饰，并且创造性地采用普通的荧光分光光度计鉴定单核苷酸多态性等位位点形式和比例，价格低廉，且操作简便，结果稳定，适合于普通的科研单位和临床医院使用，具有较大的推广价值和应用前景。

主权项

1. 一种鉴定单核苷酸多态性等位位点比例的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)制备含待测单核苷酸多态性的扩增模板，单核苷酸多态性等位位点中含有2种碱基，根据其中1种碱基设计扩增所需的上游引物A，上游引物A的5’端最后1位碱基用第1荧光基团修饰；根据其中另1种碱基设计扩增所需的上游引物B，上游引物B的5’端最后1位碱基用第2荧光基团修饰；根据单核苷酸多态性等位位点的位置设计下游引物C，下游引物C共用；上游引物A和上游引物B的3’端最后1位碱基均用硫修饰；采用3’端碱基特异性聚合酶链反应分别扩增出SNP中含2种碱基的核酸片段，反应所用的酶为具有3’-5’外切酶校正活性的高保真聚合酶，扩增完成后，去除含荧光的游离引物，得到含荧光的扩增产物；所述第1荧光基团和第2荧光基团在光谱中激发峰的位置互相分离；(2)利用荧光分光光度计分析含荧光的扩增产物，根据荧光激发光谱的位置和强度计算对应扩增产物的种类和比例，判断单核苷酸多态性等位位点的比例，判断规则如下：如果在仅第1荧光或第2荧光激发光谱位置出现单一峰，说明单核苷酸多态性等位位点纯合；如果在第1荧光和第2荧光激发光谱位置上出现2个峰，且强度基本相等，说明单核苷酸多态性等位位点比例为1∶1；如果在第1荧光和第2荧光激发光谱位置上出现2个峰，2个峰的强度相比为1∶n或n：1，说明单核苷酸多态性等位位点比例为1：n或n：1；其中n＝2、3或4。