[发明专利]来自海洋的粪产碱杆菌的培养方法及其用途

摘要

本发明是一种来自海洋的粪产碱杆菌KZJ01(Alcaligenes faecalis strain KZJ01)的培养方法，其特征在于，它经过富集培养、菌体的分离、菌株的纯化、菌株筛选、菌株的鉴定等步骤得到粪产碱杆菌KZJ01。本发明培养方法所得的粪产碱杆菌KZJ01具有抑制9种植物病原真菌菌丝生长的作用，而且对其中2种植物病原真菌的分生孢子的萌发有抑制作用。

主权项

1、一种来自海洋的粪产碱杆菌KZJ01(Alcaligenes faecalis strainKZJ01)的培养方法，其特征在于，其具体分离培养步骤如下：(1)富集培养：从连云港海域采集海泥，将海泥10g放入盛有10mL的无菌海水的三角瓶中振荡摇匀，取5mL悬浮液加入到50mL富集培养液中，170r/min，25℃条件下摇床培养48h；(2)菌体的分离：摇床培养48h后，用移液枪取富集培养48h的富集培养液1.0mL加入到盛有9.0mL无菌海水的试管中，制备成10-1的样品稀释液；然后采用梯度稀释的方法连续稀释，分别制备成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的样品稀释液；然后分别取10-5、10-6和10-7的样品稀释液0.2ml放到2216E固体培养基平板上，用涂布棒涂布均匀后，置于25℃的培养箱中培养24h，长出菌落；(3)菌株的纯化：分别挑取2216E固体培养基平板上的菌落，用三区划线的方法接种到2216E固体培养基平板上，置于25℃培养箱中培养，反复划线直至得到纯的菌株单菌落，将若干个纯化的菌株分别转接到2216E试管斜面中保存；(4)菌株筛选：按下述方法分别对上述若干个纯化的菌株进行抑制植物病原真菌实验；取纯化的菌株分别在2216E固体培养基平板上活化培养24小时，取9种植物病原真菌分别在PDA平板上活化培养3d；然后在PDA平板的中央接种活化3d的直径为5mm的植物病原真菌的菌苔，培养24小时后，在植物病原真菌四周距培养皿边缘15mm处划线接种1cm活化24小时的纯化的菌株，25℃倒置恒温培养，观察病原菌的生长状况，培养5d后测量抑菌带宽度；以不接菌为对照，实验重复3次；选取一株对9种植物病原真菌的抑菌带宽度平均值大于10mm的菌株，记为KZJ01菌株；(5)菌株的鉴定：将KZJ01菌株于25℃下培养24h，观察记录菌落和细胞形态，同时进行革兰氏染色、运动性试验、过氧化氢酶试验、生长需要NaCl试验、淀粉水解试验和硝酸盐还原试验，并进行16S rDNA测序分析；结果为：KZJ01菌株革兰氏染色阴性，无芽孢，细胞杆状；没有鞭毛，不能运动；在2216E固体培养基平板上菌落乳白半透明，边缘整齐；KZJ01菌株氧化酶反应阳性，好氧，性质初步鉴定为产碱菌属(Alcaligenes)；16SrDNA的同源性分析表明，KZJ01菌株最接近于Alcaligenes faecalis，二者的16S rDNA序列相似性为99％，该菌株即为粪产碱杆菌KZJ01(Alcaligenes faecalis strain KZJ01)。