[发明专利]沙冬青蛋白质双向电泳技术

摘要

本发明涉及一种沙冬青的蛋白质双向电泳技术，是针对极端环境中生存的植物蛋白采用双向电泳技术制备，采用本技术方案对极端环境下生存的新疆沙冬青进行的实验取得了好的效果。目前，经反复实验证明：实验样品制备全、重复性好、图谱清晰、结果可靠，可为逆境胁迫下植物蛋白质组学研究提供技术范例，是一套适用于新疆沙冬青蛋白质组分析的双向电泳技术。

主权项

1、一种沙冬青蛋白质双向电泳技术，其特征在于按下列步骤进行：a、采集沙冬青叶片，用液氮罐装运回，在实验室-80℃以下保存备用；b、定量称取完整沙冬青叶片样品，去除脂类、腊质杂质，用捣碎机液氮粉碎样品；c、将3倍的弱碱性三羟甲基氨基甲烷缓冲液，1mmol/L蛋白酶抑制剂在离心管中摇匀，4℃静置1小时，温度4℃，20000×g离心，漂去上层脂质，澄清滤液备用；d、将步骤c沉淀杂质中加入1-1.5倍8-10mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐，65mmol/L二硫苏糖醇，1％两性电解质载体，在离心管中摇匀，18℃静置1小时，在温度18℃，20000×g离心，进行二次提取，澄清滤液备用；e、将步骤c和d的澄清滤液混合，加入10％(重量体积比)聚乙烯吡咯烷酮，搅拌后温度18℃，20000×g离心5分钟，取上清液，加入4倍体积，-20℃预冷的10％(重量体积比)丙酮-三氯乙酸溶液，-20℃沉降3小时，弃上清；f、然后用冷丙酮重复洗沉淀2次，每次-20℃沉降30分钟离心，浓缩为干粉；g、蛋白质定量：采用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量；h、第一向等电聚焦电泳：蛋白质定量后取样，用上样水化液8-10mol/L尿素、4％3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐、2％IPG缓冲液，0.01mg溴酚蓝，用前加入二硫苏糖醇1.2mg配成120ul溶液，倾入IPG胶条槽中，将IPG胶条胶面向下放入槽中，除去胶面与泡胀液间的气泡，将胶面与溶液充分接触润湿，用矿物油覆盖胶条，进行等电聚焦；i、胶条平衡：按照常规方法，等电聚焦完成后将IPG胶条在平衡液6—9mol/L尿素，2—5％十二烷基硫酸钠，0.375mol/L pH8.0-8.9三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，20—30％甘油，1.5％二硫苏糖醇及6—9mol/L尿素，2—5％十二烷基硫酸钠，0.375mol/L pH8.0—8.9三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，20—30％甘油，2.5％碘乙酰胺中分别在摇床上平衡10—15分钟；j、第二向SDS-PAGE电泳使用垂直电泳，将十二烷基硫酸钠凝胶储液为30％丙烯酰胺，0.8％甲叉双丙烯酰胺，十二烷基硫酸钠凝胶缓冲液为3mol/L pH8.9三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，10％十二烷基硫酸钠，10％过硫酸铵和1％四甲基乙二胺分别进行配制，然后混合再配制成12.5％的凝胶备用；电极缓冲液：按0.1％十二烷基硫酸钠，0.025-0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷，0.192-0.384mol/L甘氨酸进行配制；再将配制的凝胶和电极缓冲液按电压80V，0.5小时；120V，2-3小时参数进行电泳，整个过程以循环水，将环境温度控制在15—20℃；k、再按常规染色考马斯亮蓝R250方法进行染色即可。