[发明专利]一种用于评估硝酸甘油类药物治疗心绞痛疗效的检测方法

摘要

本发明涉及一种用于评估硝酸甘油类药物治疗心绞痛的疗效的检测方法，其方法为：用采样拭在一个被测者口腔中左右两腮至少需要各上下刮40－60次，采集到足量的细胞样本，进行基因组DNA的抽提，对线粒体乙醛脱氢酶基因ALDH2 Glu504Lys变异进行检测，通过检测分析个体的ALDH2基因上Glu504Lys位点基因型来评估硝酸甘油类药物治疗心绞痛的疗效。本发明的优点是可用于评估硝酸甘油类药物对治疗个体心绞痛的有效性。

主权项

1.一种用于评估硝酸甘油类药物治疗心绞痛疗效的检测方法，其方法为：步骤1.检测的样品类型与采样方法：用采样拭在30个被测者口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮45次，以保证采集到足量的细胞样本；步骤2.基因组DNA的抽提方法：采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时，共抽提30个被测者样本，并用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；步骤3：荧光定量PCR反应将每一个被测者样本分别放入1个反应孔，检测线粒体乙醛脱氢酶ALDH2Glu504Lys SEQ ID NO1：rs671位点基因多态性，30个被测者样本就有30个反应孔，并增设2个不含DNA模版的NTC空白对照孔；在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABIMGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl2溶液、0.02μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、20μM的有义引物1和2各0.225μl、20μM的反义引物1和2各0.225μl、10μM的荧光探针1和2各0.25μl，去离子水5.43μl；采用5个位点的正向引物、反向引物、VIC荧光探针和FAM荧光探针工具进行检测；本发明位点的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用-MGB技术，进行检测试剂合成；将32个反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟检测，经重复实验验证，基因分型的准确率达到了99％以上，重复性达到了100％。反应结束后取出后再放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，并自动将30个被测者样本和2个NTC的检测数据对号入座到图1中，即线粒体乙醛脱氢酶ALDH2 Glu504Lys SEQ ID NO1：rs671图；步骤4数据读取将ABI7900型荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的图和NTC空白对照进行比较，理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；如图1 ALDH2 Glu504Lys SEQ ID NO1：rs671所示在检测结果图中，共有32个点，每个点代表一个被测者样本或NTC的检测结果，坐标轴(X：0.0-0.1 Y：0.2-0.3)区域为NTC空白对照、坐标轴(X：0.05-0.2Y：1.2-1.4)区域为GG基因型、坐标轴(X：0.45-0.6 Y：0.9-1.1)区域为GA基因型、坐标轴(X：0.6-0.8 Y：0.3-0.5)区域为AA基因型；其中，携带GA基因型时酶的活性显著降低，携带AA基因型时酶的活性几乎完全丧失；步骤5.结果分析5-1检测结果为GG您的ALDH2 Glu504Lys基因型为GG，为正常基因型，在没有其他特殊环境因素以及特殊基因变异情况的影响下，不会影响硝酸甘油类药物的有效率；5-2检测结果为AG；您的ALDH2 Glu504Lys基因型为GA，根据现有研究表明该基因型的酶活性低于GG基因型，与携带GG基因型的人群相比，携带AG的基因型的人群硝酸甘油类药物有效率有所降低，强烈建议您在医生指导下谨慎使用硝酸甘油类药物治疗心绞痛；5-3检测结果为AA您的ALDH2 Glu504Lys基因型为AA，根据现有研究表明该基因型的酶活性几乎完全丧失，与携带GG基因型的人群相比，携带AA的基因型的人群硝酸甘油类药物有效率显著降低甚至完全失效，强烈建议您在医生指导下谨慎使用硝酸甘油类药物治疗心绞痛。